变异链球菌ldh-luc基因荧光报告株对氯己定的敏感性实验研究

霍丽珺 凌均棨

牙菌斑是多细菌性生物膜，变异链球菌与众多细菌共存其中。常规的检测方法难以将变异链球菌从生物膜中分离出来。目前已有学者将荧光素酶报告系统用于检测抗菌剂对细菌的作用，并获得成功[1-2]。本课题组前期成功构建了变异链球菌ldh-luc基因荧光报告株，已证实可用其代替野生株进行相关实验研究[3-4]。为验证本课题组前期构建的变异链球菌ldh-luc基因荧光报告株在生物膜状态下对抗菌剂的敏感性，本实验采用氯己定作用于S.mutansldh-luc基因荧光报告株，观察其生长状态及荧光活性的变化及相互关系。

1 材料与方法

1.1 菌株

实验所用菌株及相关特性见表 1。

1.2 方法

1.2.1 氯己定对S.mutansldh-luc基因荧光报告株和野生株的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations，MICs)S.mutanUA 159野生株复苏接种至10 ml心脑浸出液(brian heart infusion,BHI,广东环凯微生物科技有限公司)液体培养基，S.mutansldh-luc基因荧光报告株(下文简称荧光报告株)复苏接种至含有250 μg/ml大观霉素(spectinomycin,Spec,Sigma,USA)的BHI培养基中，37 ℃厌氧培养过夜。次日菌液1∶20稀释于BHI培养基中，37 ℃厌氧培养2.5 h，调整菌液浓度为105～106CFU/ml。吸取50 μl无菌BHI培养基加入圆底96 孔板1～12 孔中，往第1列孔中加入40 μl BHI 培养基，加入10 μl 1 mg/ml氯己定(Sigma,USA)溶液，吹打混匀。吸取第1孔中的50 μl加入第2孔中，吹打混匀，再吸取50 μl加入第3孔，依次进行序列稀释，直至第10孔，弃去50 μl，然后往第1～12孔中加入50 μl BHI培养基。再吸取100 μl菌液加入96 孔板中，37 ℃厌氧培养，24 h后观察结果。其中第11孔为阴性对照，为不含抗菌剂的细菌菌液，第12孔为空白对照，不含细菌的新鲜培养基。吸取100 μl菌液序列稀释后涂板，37 ℃厌氧培养过夜，菌落计数。MICs为未见活菌生长孔的最低浓度。每浓度3 个重复，实验重复3 次。

表 1 本实验所用菌株

1.2.2 浮游态荧光报告株对氯己定的敏感性实验

荧光报告株复苏接种至含250 μg/ml Spec的BHI培养基中，37 ℃厌氧培养过夜。次日菌液1∶20稀释于BHI培养基中，37 ℃厌氧培养2.5 h，调整菌液浓度为～108CFU/ml。菌液中加入氯己定，终浓度为1 μg/ml，37 ℃厌氧培养。30 min、60 min时吸取菌液加入96 孔白板，每孔200 μl，每孔加入50 μl 1 mmol/L D-luciferin(Promega,USA)，发光检测分析仪(Berthold centro LB960,Tecan,Austra)测相对光单位值RLU(Relative light unit,RLU)，未加D-luciferin的菌液为空白对照。经氯己定处理60 min菌液离心(4 000 g)5 min，弃上清，加入0.5%蔗糖的BHI培养基，37 ℃厌氧培养。在30、60和90 min时将菌液吹打混匀后加入96孔白板和96孔透明板中。96孔白板每孔200 μl菌液，加入50 μl 1 mmol/L D-luciferin，测RLU，未加D-luciferin的菌液为空白对照。96孔透明板中每孔200 μl菌液，酶标仪(Infinite,Tecan,Austra)测A600；取100 μl序列稀释后涂板于含250 μg/ml Spec的BHI琼脂平板，37 ℃厌氧培养48 h，菌落计数(colony forming units,CFU)。每组3 个样本，实验重复3 次。采用统计分析软件SPSS 13.0，应用单因素方差分析氯己定作用后荧光报告株活性(A600,CFU,RLU)的差异，P<0.05视为差异有统计学意义。

1.2.3 生物膜状态荧光报告株对氯己定敏感性实验

荧光报告株复苏接种至含有250 μg/ml Spec的BHI培养基中，37 ℃厌氧培养过夜。次日菌液1∶20稀释于0.5%蔗糖BHI培养基中，接种至平底96孔白板和透明板中，每孔200 μl，37 ℃厌氧培养24 h，形成生物膜。弃上清，加入200 μl 0.5%蔗糖BHI培养基，37 ℃厌氧培养30 min，96孔白板每孔加入50 μl 1 mmol/L D-luciferin，测RLU，未加D-luciferin菌液为空白对照。96孔透明板中生物膜吹打混匀，测A600，吸取100 μl菌液，序列稀释后涂布于含250 μg/ml Spec的BHI琼脂平板，37 ℃厌氧培养48 h，菌落计数。将氯己定加入上述96孔白板中的生物膜，终浓度为10 μg/ml，37 ℃厌氧培养。在30、60 min时，每孔加入50 μl 1 mmol/L D-luciferin，测RLU，未加D-luciferin菌液为空白对照。经氯己定处理60 min生物膜弃上清，加入0.5%蔗糖BHI培养基200 μl，37 ℃厌氧培养。在30、60和90 min时，每孔加入50 μl 1 mmol/L D-luciferin，发光检测分析仪测RLU，未加D-luciferin的菌液为空白对照。在30、60和90 min时，将生物膜振荡吹打混匀，取200 μl加入96孔透明板中，酶标仪测其A600；取100 μl序列稀释后涂于含250 μg/ml Spec的BHI琼脂平板，37 ℃厌氧培养48 h，菌落计数。每组3 个样本，实验重复3 次。

1.3 统计学分析

采用统计分析软件SPSS 13.0，应用单因素方差分析氯己定作用后荧光报告株活性(A600, CFU, RLU)表达差异，P<0.05视为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 氯己定对荧光报告株和野生株的MICs

氯己定对荧光报告株和野生株有明显地抗菌作用。其MICs均为(0.25±0.39) μg/ml(表 2)。

表 2 氯己定对S. mutans ldh-luc基因荧光报告株和野生株的MICs (μg/ml)

2.2 氯己定对浮游态荧光报告株荧光活性的作用

氯己定对浮游态荧光报告株的生长状态及荧光活性作用如图 1。图 1A所示为氯己定处理后荧光报告株RLU的变化情况。氯己定作用30 min后，荧光报告株的RLU呈下降趋势，作用60 min后，RLU下降至检测水平以下，移走氯己定，加入BHI培养基培养30、60、90 min，仍未检出RLU，未加抗菌剂的阴性对照组的RLU随细菌的生长而持续增加。图 1B所示为荧光报告株经氯己定处理前后A600的变化情况。氯己定处理后荧光报告株A600略有下降，而阴性对照组A600平均增加0.3。图 1C所示为荧光报告株处理前后CFU的情况。氯己定处理后CFU计数为0，阴性对照组菌液生长良好，CFU计数增加。这一结果与荧光报告株处理前后RLU的变化一致，氯己定处理后未检测到RLU，阴性对照组RLU上升(图 1D)。氯己定处理前后的CFU计数和RLU的差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3 氯己定对生物膜状态荧光报告株荧光活性的作用

经氯己定作用的24 h生物膜的荧光活性变化与浮游态荧光报告株相似，氯己定作用24 h生物膜30 min后，RLU呈下降趋势，作用60 min后RLU降至检测水平下，移走氯己定，加入BHI培养基培养30、60、90 min，RLU仍未检出，未加抗菌剂的阴性对照组RLU随着细菌的生长而持续增加。荧光报告株24 h生物膜经氯己定作用后的A600(图 2B)、CFU(图 2C)和RLU(图 2D)均下降，阴性对照组的A600、CFU和RLU伴随细菌的生长均上升。氯己定作用前后的24 h生物膜的CFU计数和RLU的差异具有统计学意义(P<0.05)。

图 1 氯己定对浮游态S. mutans ldh-luc基因荧光报告株荧光活性的作用

图 2 氯己定对生物膜状态S. mutans luc基因荧光报告株荧光活性的作用

3 讨 论

活菌计数法是测定细菌生长状况的有效方法，该法测出的为活菌总数，能表示细菌真实的生长情况，但此法操作复杂，过程繁琐，颇为费时。近年来，不断有学者将荧光素酶报告系统用于检测抗菌剂对细菌的作用，用作高效筛选抗菌剂的工具获得了成功，Arain等[1]采用荧光报告株做抗菌剂活性实验，Shawar等[2]用牛分支杆菌荧光报告株检测抗菌剂对其的作用，Jawhara等[5]采用大肠杆菌荧光报告株观察抗菌剂对体内伤口的作用，Loeliger等[6]采用戈登链球菌荧光报告株检测了抗菌剂对其的作用。因为内源性ATP体现了细胞的代谢状态，荧光素酶检测不用额外加入外源性ATP，可如实反映环境或外界因素对细菌内源性ATP作用而引起细菌生存状态的改变，本实验利用了这一特性，构建了S.mutansldh-luc基因荧光报告株用以实时观测抗菌剂对变异链球菌的作用[3-4]。由于实时检测系统必须能反映加入抗菌剂后任一个时间点的细菌状态，本实验采用氯己定作用于浮游态荧光报告株，观察其生长状态、荧光活性变化及相互关系，以验证荧光报告株的有效性。氯己定是一种广谱抗生素，对多种细菌具有抗菌作用[7]。本实验结果显示氯己定对荧光报告株和野生株的MICs相同，二者对氯己定的敏感性一致。氯己定对浮游态荧光报告株的生长状态及荧光活性作用的结果显示，RLU的数值与活菌计数法的结果一致。说明S.mutansldh-luc基因荧光报告株的荧光活性可以实时反映抗菌剂对细菌的作用。因此相对活菌计数法，荧光素酶的测定方法简单易行，操作简便，能快速反映细菌的生长情况，是检测抗菌剂作用的有效方法。

为了验证生物膜状态下荧光报告株对抗菌剂的敏感性，本实验采用氯己定作用于生物膜状态荧光报告株，观察其生长状态、荧光活性变化及相互关系。结果显示氯己定作用荧光报告株24 h生物膜的荧光活性变化与浮游态荧光报告株相似，荧光报告株24 h生物膜经氯己定作用后的A600、CFU和RLU均下降。统计结果分析显示，氯己定作用前后的24 h生物膜的CFU计数和RLU的差异具有统计学意义，说明在不破坏生物膜结构情况下S.mutansldh-luc基因荧光报告株能准确反映抗菌剂对生物膜状态下细菌的作用，与生物膜活菌计数效果相似，为实时评价抗菌剂对生物膜状态下变异链球菌的作用提供有效的方法。