基于蚕丝蛋白的低温保护剂用于梅山猪耳成纤维细胞的低温保存研究

(上海理工大学医疗器械与食品学院 上海 200093)

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，在临床治疗和科学研究中应用广泛。为了减少冻融过程对细胞造成的损伤和致死，低温保护剂的组分及添加步骤至关重要[1]。1959年，J. E. Lovelock等[2]创新性地以体积分数为10%二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂，同时加入体积分数为5%～90%的血清作为冷冻储存液来保存细胞。至今这两种物质仍然作为主要成分出现在保护剂配方中。DMSO能减少细胞脱水和胞内冰的形成，维持细胞膜的完整性[3]，但高体积分数的DMSO会对细胞造成严重的毒性损伤。胎牛血清(FBS)常作为细胞低温保存的血清，其保护机制是通过改变渗透压，在冷冻时促使细胞脱水，解冻时抑制水分快速渗入并脱出胞内的保护剂，促进溶液玻璃化形成，保护细胞膜和细胞的完整性[4]。但FBS具有携带病毒、感染疾病的风险，如异种动物传染病、疯牛病等，且价格昂贵，批次之间稳定性差[5]。

蚕丝是一种天然的高分子材料，无污染且来源丰富，主要由丝胶蛋白和丝素蛋白组成。近年来，丝胶蛋白被应用于细胞的低温保存领域，发现其具有替代FBS作为冷冻介质的作用。据文献报道，基于丝胶蛋白的无血清保护剂相继成功冻存了仓鼠骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、卵巢细胞[6]，小鼠的杂交瘤细胞、大鼠胰岛瘤细胞[7-9]，人的肝细胞[10]，大鼠胰岛细胞[11]及牛精子和胚胎[12-13]。丝素蛋白被广泛地应用于药物释缓、骨组织修复、人工皮肤、血管等生物医用材料的制备，以及降血糖、抑菌等医疗保健方面[14-15]。但将丝素蛋白加入低温保护剂中，探讨其是否具有低温保护作用的潜力，目前还未有相关的公开报道。

以梅山猪耳成纤维细胞作为实验材料，具有取材方便、效率高等优点，并且体细胞和生殖细胞同样具有全能型，可以作为动物活体保种的有利辅助方式[16-17]。本文将蚕丝蛋白加入低温保护剂中，用于梅山猪耳成纤维细胞的低温保存。用丝胶蛋白替代FBS，避免因血清带来的污染及病毒感染的风险，并在保护剂中添加丝素蛋白来降低DMSO的体积分数，减少对细胞的损伤。以期研发一种基于天然蚕丝蛋白的新型、低毒性的无血清低温保护剂，并应用于其他细胞、组织的低温保存实践中。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：蚕茧(广西平果桑移天下丝绸有限公司)，梅山猪耳成纤维细胞(上海市农业科学院)。

试剂：丝胶蛋白(日本和光纯药)，HyClone胎牛血清(FBS)(上海博升生物科技有限公司)，二甲基亚砜(DMSO)(中国医药集团上海化学试剂公司)。

1.2 设备与耗材

旋转蒸发仪(德国IKA公司)，二氧化碳培养箱(上海博讯实业有限司)，超低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)，低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，酶标仪(英国柏楉有限公司)，程序降温盒(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)，透析袋(美国Rebus公司)。

1.3 方法

1.3.1丝素蛋白的制备

参考文献[18]的制备方法，将蚕茧除杂处理后，在质量浓度为0.2%的碳酸钠溶液中进行脱胶处理30 min；得到的丝素纤维冲洗烘干后，60 ℃条件下用9.3 mol/L溴化锂溶解4 h；将丝素蛋白溶液进行透析、离心、浓缩等处理，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2细胞培养

将猪耳成纤维细胞接种于含体积分数为20%FBS、1%丙酮酸钠、1%双抗、1%非必需氨基酸的DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度条件下培养，待细胞生长至汇合，进行传代/冻存等操作。

1.3.3低温保护剂的配制

丝胶蛋白实验：基础冻存液为添加体积分数为10%DMSO的DMEM。对照组1和2分别为添加和不添加体积分数为20%FBS的低温保护剂，实验组3～7分别添加了质量浓度为10%、5%、2%、1%、0.5%的丝胶蛋白来替代体积分数为20%FBS，配制基于丝胶蛋白的新型无血清低温保护剂。

丝素蛋白实验：基础冻存液为添加体积分数为20%FBS的DMEM。对照组1为添加体积分数为10%DMSO的低温保护剂，实验组2～19将体积分数为10%、8%、4%、2%、1%及不添加丝素蛋白和体积分数为10%、5%、2.5%及不添加DMSO进行组合，配制基于丝素蛋白的新型低毒性低温保护剂。

筛选出丝胶蛋白和丝素蛋白的最优浓度后，选择最优浓度进行联用，配制基于天然蚕丝蛋白的新型、低毒性的无血清低温保护剂。

1.3.4细胞冻存

将消化后的细胞悬液转移至离心管中，离心去上清。每组加入1 mL配制好的低温保护剂，轻轻吹打均匀，转移至2 mL冻存管。将标记好的冻存管放入程序降温盒中，置于-80 ℃深低温冰箱中冻存一周。

1.3.5细胞复苏

从冰箱中取出冻存管，在37 ℃水浴锅中快速摇晃冻存管，直至管内细胞悬液完全融化。室温下5 min内用25 ℃含血清培养基稀释。离心去掉上清液，再加入1 mL培养液重悬细胞。

1.3.6细胞活力检测

台盼蓝染色法[19]：取10 μL体积分数为0.4%台酚蓝溶液和10 μL复水后的细胞悬浮液，混合均匀并静置1 min后，滴加在细胞计数板上，按式(1)进行计数：

(1)

MTT法[19]：取复温后的细胞悬液置于96孔板中，每种低温保护剂设置3个平行样，另加一组新鲜细胞作为对照组，一组细胞培养基作为空白组。每孔加入100 μL实验样本，再每孔加入20 μL MTT溶液，低速震荡融合后置于培养箱中避光孵育4 h。4 h后吸除上层溶液，每孔加入150 μL DMSO，再低速震荡10 min。待结晶物充分溶解后，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光值，按式(2)进行计算：

(2)

24 h贴壁率：复温后的细胞接种于细胞培养瓶中，加入培养基后置于细胞培养箱中培养。24 h后收集上层培养液，并用D-Hanks冲洗两遍后，收集所有上清液，计数未贴壁细胞。贴壁细胞用胰酶消化后离心，取上清液，加1 mL培养基重悬，计数贴壁细胞。同时观察细胞的生长情况和形态变化。按式(3)计算细胞的贴壁率：

(3)

1.4 统计学分析

所有实验数据都来自于至少3组平行独立实验，均采用平均值±标准差的形式，应用SPSS 16.0统计软件进行数据处理、统计及显著性分析。

2 实验结果

2.1 丝胶蛋白冻存细胞的存活率、MTT存活率及24 h贴壁率

将基于丝胶蛋白的无血清低温保护剂应用于猪耳细胞的冻存实验，所得的细胞存活率、MTT存活率以及24 h贴壁率如表1所示。

表1 基于丝胶蛋白低温保护剂的细胞存活率、MTT存活率及24 h贴壁率Tab.1 The survival rate, MTT assay and 24 h adherent rate with various concentration of sericin protein

注：用Duncan′s multiple range test法进行多重比较，同列标有不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)，标有相同小写字母表示组间差异不显著(P>0.05)。v/v为体积分数；w/v为质量浓度。下表相同。

由表1可知，对照组1和对照组2的细胞存活率、MTT存活率及24 h贴壁率相比存在显著差异(P<0.05)，说明添加体积分数为20%FBS后能显著提高细胞的存活率和贴壁率，添加FBS对细胞的低温保存具有一定的作用。去除FBS后，分别添加质量浓度为10%、5%、2%、1%、0.5%的丝胶蛋白，可以看出添加质量浓度1%丝胶蛋白的细胞存活率及24 h贴壁率最好，且显著高于对照组1(P<0.05)。丝胶蛋白质量浓度从10%降至1%，细胞的存活率和24 h贴壁率虽没有严格按照线性变化，但呈现增长的趋势。质量浓度继续降为0.5%时，冻存效果开始下降。说明添加质量浓度为1%丝胶蛋白能有效替代FBS，更好地冻存细胞。

2.2 丝素蛋白冻存细胞的存活率、MTT存活率及24 h贴壁率

将基于丝素蛋白的低温保护剂进行细胞冻存实验，分析细胞的存活率、MTT存活率及24 h贴壁率来验证细胞冻存效果。实验结果如表2所示。

实验组1为对照组，添加体积分数为10%DMSO细胞的存活率和24 h贴壁率都较高，说明DMSO对细胞冻存具有显著的保护作用。不添加丝素蛋白的情况下，DMSO体积分数从5%降至0，细胞的存活率和24 h贴壁率分别从73.37%、78.55%降至11.88%、6.86%，呈现明显的下降趋势，且有显著性差异(P<0.05)。说明DMSO体积分数的下降对细胞存活率和24 h贴壁率具有显著影响。降低DMSO体积分数且添加丝素蛋白后，随着其体积分数的不断增加，冻存效果也显著增强。当DMSO体积分数为5%时，分别添加体积分数为1%、2%、4%、8%、10%的丝素蛋白，细胞存活率和24 h贴壁率分别从68.95%、69.19%增长至89.35%、88.94%，具有显著性差异(P<0.05)。其中5% (v/v) DMSO+ 10% (v/v) 丝素蛋白组与对照组相比，细胞的存活率和24 h贴壁率均高于对照组，说明添加体积分数为10%丝素蛋白能有效补偿体积分数为5%DMSO的作用效果。但是当DMSO体积分数为0时，即使添加体积分数为10%丝素蛋白，细胞的存活率和24 h贴壁率均较低，说明丝素蛋白并不能完全替代DMSO。

表2 基于丝素蛋白低温保护剂的细胞存活率、MTT存活率及24 h贴壁率Tab.2 The survival rate, MTT assay and 24 h adherent rate with various concentration of fibroin protein

注：基础液为添加体积分数为20%FBS的DMEM。

图1所示为基于丝素蛋白低温保护剂对细胞的冻存存活率影响，将保护剂1、2、3、4、17、18、19七组数据进行对比。分析保护剂1、2、3可知，DMSO体积分数从10%降至2.5%，细胞存活率虽呈下降趋势，但影响并不显著，说明体积分数为2.5%DMSO就能保障较好的冻存效果。在保护剂2和3的基础上添加体积分数为10%丝素蛋白即保护剂17和18，细胞存活率分别从73.37%提高至89.35%、68.47%提高至78.47%，与对照组1相比无显著差异(P>0.05)。说明DMSO体积分数高于2.5%时，DMSO起主要保护作用，但添加丝素蛋白后效果更显著。分析保护剂4和19可得，当DMSO体积分数为0时，添加体积分数为10%丝素蛋白后，细胞的存活率从11.88%提高至43.07%，说明无DMSO作用时，丝素蛋白对冻存的保护作用显著。体积分数为5%DMSO添加体积分数为10%丝素蛋白的细胞存活率与对照组相比无显著差异，说明体积分数为10%丝素蛋白能部分替代DMSO的作用效果，将原有10%DMSO体积分数降至5%。但对比保护剂1、4和19，发现丝素蛋白并不能完全取代DMSO，单独作用时效果不如DMSO。

图1 基于丝素蛋白低温保护剂对细胞的冻存存活率影响Fig.1 Effect of fibroin protein on cell cryopreservation

2.3 蚕丝蛋白冻存细胞的存活率、MTT存活率及24 h贴壁率

结合2.1及2.2的实验结果可知，丝胶蛋白的最适质量浓度和丝素蛋白的最适体积分数分别为1%和10%。将丝胶蛋白与丝素蛋白进行联用，制备基于天然蚕丝蛋白高效、低毒性的无血清低温保护剂(DMEM+5% (v/v) DMSO+1% (w/v) 丝胶蛋白+10% (v/v) 丝素蛋白)。将该低温保护剂用于细胞冻存实验，从细胞的存活率、MTT存活率以及24 h贴壁率进行分析，探究其冻存效果。结果如表3所示。

表3 基于蚕丝蛋白低温保护剂的细胞存活率、MTT存活率以及24 h贴壁率Tab.3 The survival rate, MTT assay and 24 h adherent rate with various concentration of silk protien

由表3可知，基于蚕丝蛋白的复合保护剂与对照组1相比，细胞存活率与MTT存活率较低，24 h贴壁率无明显差异；与对照组2相比，细胞存活率与MTT存活率无显著差异，24 h贴壁率较高。说明将质量浓度为1%丝胶蛋白与体积分数为10%丝素蛋白联用后，能达到较好的冻存效果。该新型低温保护剂，用天然生物材料蚕丝蛋白既替代了FBS又降低了DMSO的体积分数，同时保障了较高的细胞存活率和24 h贴壁率。

3 讨论

血清富含生长因子、激素、氨基酸和其他营养物质，含体积分数为20%FBS的培养基普遍应用于哺乳动物细胞的培养中[20]。FBS大多依靠进口，价格昂贵，还具有携带病毒、感染疾病的风险。丝胶蛋白是一种球状蛋白，由18种氨基酸组成，具有良好的亲水性和生物相容性，与FBS相比天然安全、来源丰富、价格低廉，并且丝胶蛋白经高压蒸气灭菌和过滤除菌后作用效果不变[21]，适用于细胞的无菌培养。据报道[6-13]，丝胶蛋白替代FBS制备的新型无血清低温保护剂，已经成功冻存多种哺乳动物细胞。说明在细胞的冻存中，丝胶蛋白能有效替代FBS，并维持更高的细胞活性，这与本文实验得出的结论一致。但目前还未见珍稀和优良物种体细胞冻存研究的相关报道，本实验为研究其他物种体细胞的低温保存提供了一定的参考。S. Terada等[22]发现添加质量浓度为0.25%～0.5%丝胶蛋白的抗冻剂能有效减少脂质过氧化的有害影响，防止氧化应激，使解冻后精液质量显著提高，同时发现当丝胶蛋白质量浓度高于1%时，则不利于抑制脂质的过氧化，高浓度的渗透压也影响精液的质量。本实验中，丝胶蛋白质量浓度从1%提高至10%，细胞的存活率和24 h贴壁率呈下降趋势，这与文献[22]的结论一致。但丝胶蛋白质量浓度低于1%时，冻存效果显著下降。这可能与细胞的种类有关，对于猪耳成纤维细胞，丝胶蛋白浓度过高会抑制细胞表面分子进入胞内，引起渗透性胞内脱水，而浓度过低则起不到足够的保护作用。因此，针对不同的细胞类型需要筛选丝胶蛋白的最适质量浓度。

DMSO是目前使用最广泛的低温保护剂，且体积分数为10%DMSO被认为是最适合细胞冻存的体积分数[23-24]。但DMSO的毒性随着剂量的增加和温度的升高而升高，细胞冻存效果明显下降。有研究者通过添加糖类[25-26]或氨基酸类[27]物质来减弱DMSO的体积分数，并取得了一定成果。本文创新性的将丝素蛋白用于细胞的低温保存中，以期达到削弱DMSO体积分数或替代DMSO的作用。丝素蛋白含有丰富的氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸含量约占87%。丝素蛋白具有两性荷电的特殊性能，天然无毒，良好的人体亲和性和生物相容性等优良性能。虽然目前对于丝素蛋白能作为低温保护剂的作用机制尚不明确，但从丝素蛋白的内部结构研究发现，丝素蛋白通过酸、碱或酶彻底水解后形成丝素肽。丝素肽能与水分子之间形成较强的氢键作用，这些氢键的存在会减弱冰晶形成所需的相变驱动力，未冻结水分含量降低，从而对细胞起到保护作用[28-30]。本实验得出体积分数为10%丝素蛋白能有效补偿体积分数为5%DMSO 的作用效果，但并不能完全替代DMSO，仅添加体积分数为10%丝素蛋白的作用还不明显。随着丝素蛋白体积分数的提高，细胞的存活率和贴壁率均有显著提高，说明高浓度的丝素蛋白作用更显著。但目前由于丝素蛋白制备工艺的限制，最高体积分数只能达到10%。因此，在丝素蛋白的制备和浓度上还有一定的改进空间。

4 总结与展望

本文以梅山猪耳成纤维细胞为研究对象，探究蚕丝蛋白对细胞低温保存的效果。制备的复合型低温保护剂1% (w/v) 丝胶蛋白+10% (v/v) 丝素蛋白+ 5% (v/v) DMSO用于冻存猪耳成纤维细胞，实验结果所得的存活率、MTT存活率及24 h贴壁率分别为82.60%、83.02%、88.03%。该新型低温保护剂不仅替代了FBS，部分降低了DMSO的体积分数，还能保证较好的冻存效果。本文建立的基于天然蚕丝蛋白的低毒性、无血清低温保护剂为其他哺乳动物体细胞低温保存提供了一定的参考，但对于不同的细胞，丝胶蛋白和丝素蛋白的最优浓度和配比，能否完全替代FBS或降低DMSO体积分数还需要进一步研究，并且结合不同的降温和解冻方法，以提高细胞冻融后的存活率。