意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中的差异表达环状RNA及其调控网络分析

郭睿，陈华枝，熊翠玲，郑燕珍，付中民，徐国钧，杜宇，王海朋，耿四海，周丁丁，刘思亚，陈大福



意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中的差异表达环状RNA及其调控网络分析

郭睿，陈华枝，熊翠玲，郑燕珍，付中民，徐国钧，杜宇，王海朋，耿四海，周丁丁，刘思亚，陈大福

（福建农林大学蜂学学院，福州 350002）

【目的】环状RNA（circular RNA，circRNA）在可变剪接、转录调控和来源基因的表达调控等方面具有重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂（，简称意蜂）工蜂中肠发育过程中circRNA的表达谱及其发育过程中的差异表达circRNA（differentially expressed circRNA，DEcircRNA），进而在转录组水平探究DEcircRNA在中肠发育中的作用。【方法】基于前期获得的意蜂7和10日龄工蜂中肠样品（Am7和Am10）的全转录组数据，利用find_circ软件从质控后的数据中预测circRNA。采用RPM算法归一化处理得到circRNA的表达量。利用DEGseq软件对circRNA进行差异分析，按照差异倍数（fold change）≥2、＜0.05及错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05条件筛选DEcircRNA。通过BLAST比对GO和KEGG数据库，对DEcircRNA的来源基因进行功能和代谢通路注释。利用TargetFinder软件预测DEcircRNA-miRNA及DEcicRNA-miRNA-mRNA调控网络，通过Cytoscape v.3.2.1软件对调控网络进行可视化。通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证测序数据的可靠性。【结果】意蜂中肠各样品比对上参考基因组的短序列读段数平均为19 616 356条。Am7与Am10的组内Pearson相关系数均≥0.950。共预测出256个DEcircRNA，包括105个上调circRNA和151个下调circRNA。Novel_circ_009675和novel_circ_013879分别在Am7和Am10中高量表达。DEcircRNA的来源基因可注释到包括结合、单组织进程及细胞进程在内的32个GO条目，其中分别有35、35和7个来源基因注释到催化活性、代谢进程和应激反应。上述来源基因还可注释到35条KEGG代谢通路，其中分别有5、5和4个来源基因注释到Hippo信号通路、内吞作用和吞噬体；进一步分析发现分别有1、2和2个来源基因注释到磷酸肌醇代谢、淀粉和蔗糖代谢和半乳糖代谢等物质代谢通路，5、4、3、1和1个来源基因注释到内吞作用、吞噬体、溶酶体、泛素介导的蛋白水解和MAPK信号通路等免疫通路。上述结果表明相应的DEcircRNA广泛参与意蜂工蜂中肠的生长发育、新陈代谢和免疫防御。DEcircRNA-miRNA调控网络分析结果显示，141个DEcircRNA可靶向结合107个miRNA，其中多数仅能结合1—2个miRNA，但novel_circ_011577和novel_circ_010719结合的靶miRNA数可达32和28个；此外，mir-136-y、ame-miR-6001-3p及mir-136-y结合的circRNA数最多，分别为15、14和14个，表明相应的DEcircRNA可作为竞争性内源RNA在意蜂中肠发育过程发挥作用。进一步构建DEcircRNAs-ame-miR-6001-3p-mRNA调控网络，分析结果显示14个DEcircRNA可共同靶向结合ame-miR-6001-3p，表明它们可能通过调控ame-miR-6001-3p对意蜂中肠干细胞的分裂和分化进行间接调控。随机选取6个DEcircRNA进行RT-qPCR验证，结果显示5个DEcircRNA的表达量变化趋势与测序结果一致，证实了本研究测序结果的可靠性。【结论】通过对意蜂工蜂中肠发育过程中的DEcircRNA深入分析，提供了circRNA在意蜂工蜂中肠发育过程中的表达谱和差异表达信息，揭示了DEcircRNA在中肠发育过程中的作用，为中肠发育相关的关键circRNA的筛选和功能研究打下了基础。

意大利蜜蜂；中肠；环状RNA；调控网络；发育

0 引言

【研究意义】蜜蜂是自然界最重要的授粉昆虫，也是社会行为学模式昆虫，具有非常重要的经济和生态价值[1-2]。意大利蜜蜂（，简称意蜂）属于西方蜜蜂（），具有优越的采集能力、造脾能力和分泌蜂王浆能力，在世界各地的养蜂生产中广泛使用[3]。目前，有关蜜蜂肠道的发育机理及调控机制的研究十分滞后。对于环状RNA（circular RNA，circRNA）在蜜蜂肠道发育过程中的作用，相关信息仍然缺失。利用circRNA-seq技术对意蜂工蜂中肠进行测序，并对中肠发育过程中的差异表达circRNA（DEcircRNA）及其调控网络进行深入分析，可揭示DEcircRNA在中肠发育过程中的作用，为关键circRNA的筛选和功能研究打下基础。【前人研究进展】CircRNA是新近发现的一类非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），通过外显子或/和内含子的反向剪切形成环化RNA分子[4]。CircRNA大量存在于真核细胞中，在不同物种中具有保守性、丰富性、稳定性、组织表达特异性和时序表达特异性等特点[5]。CircRNA已被证明具有多种生物学调控功能，包括作为微小RNA（microRNA，miRNA）“海绵”，形成RNA-蛋白质复合物（RNA-binding protein，RBP），以及调控靶基因的转录和可变剪接等[6]。最新的研究结果表明含有核糖体进入位点[7]的circRNA能够翻译蛋白[8]。与线性RNA相比，circRNA缺少5′帽子和3′尾巴结构，稳定性更高且能抵抗核糖核酸外切酶RNase R的消化，因而成为理想的生物标志物[9]。利用最新的高通量测序技术和生物信息学分析方法，已在人类[10-12]、动物[13]、植物[14]及微生物[8,15-16]中预测和鉴定出circRNA。SALZMAN等[12]对人类15种细胞类型中的circRNA进行预测分析，发现circRNA具有组织特异性、保守性及潜在的调控功能；SHEN等[13]对斑马鱼肌肉、卵巢及眼睛等不同组织进行高通量测序，利用3种算法对circRNA进行预测，共预测到3 868个circRNA，进而对具有较高可信度的176个circRNA进行实验验证，发现其中84%真实存在；LU等[14]对水稻进行深度测序及生物信息学分析，共预测出2 354个circRNA，进一步分析发现circRNA具有相当数量的亚型；GUO等[16]对蜜蜂球囊菌（）的菌丝及孢子混合样品进行高通量测序，通过生物信息学分析发掘出551个长度介于200—600 nt的circRNA，并发现它们与miRNA存在复杂的调控关系。较之人类和哺乳动物，昆虫的circRNA研究还处于初级阶段，相关信息极为有限[17-19]。WESTHOLM等[17]在全基因组水平对果蝇（）的circRNA进行分析，发现其circRNA具有组织表达特异性，并且可作为果蝇衰老的潜在生物标志物；GAN等[18]通过对家蚕（）中肠和后肠进行高通量测序，共预测出来源于1 727个基因的3 155个circRNA，同样具有组织表达特异性，进一步分析发现中肠和后肠中的来源基因的功能和代谢通路注释信息类似；CHEN等[19]对西方蜜蜂蜂王的卵巢组织中的circRNA进行预测和分析，发掘出12 211个circRNA，并通过对刚产卵蜂王、处女王和限制产卵蜂王进行比较分析推测DEcircRNA可通过竞争性结合miRNA在蜂王卵巢组织活化及产卵过程中发挥作用。较多的研究表明circRNA可作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）与mRNA竞争性结合miRNA，间接调控基因表达[20-22]。CHENG等[21]对椎间盘退行性病变的病人髓核细胞和组织通过微距阵芯片分析，发现circVMA21能够通过吸附miR-200c抑制细胞凋亡相关的X蛋白基因，将circVMA21注射到患有椎间盘退行性病变的大鼠模型可使疾病得到缓解；ZHENG等[22]通过对6个正常组织和7个癌变组织进行深度测序，发现与癌变相关的CircHIPK3包含结合9个miRNA的18个潜在结合位点，可靶向结合miR-124抑制肿瘤形成。【本研究切入点】蜜蜂中肠既是消化食物、吸收营养的重要场所[23]，也是多种病原微生物寄生的主要部位。笔者所在课题组前期已在mRNA组学水平探究了意蜂4、5和6日龄幼虫肠道发育过程中的基因表达谱和差异表达规律[24]，并在长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）组学水平探究了意蜂7和10日龄工蜂中肠的差异表达lncRNA及其调控网络[25]。目前，蜜蜂circRNA的信息极为有限，circRNA在蜜蜂中肠发育中的作用尚不明确。【拟解决的关键问题】通过生物信息学方法对意蜂7和10日龄工蜂中肠发育过程中的差异表达circRNA（DEcircRNA）及其调控网络进行深入分析，提供意蜂工蜂中肠的circRNA表达谱及差异表达信息，并在组学水平探究DEcircRNA在中肠发育过程中的作用。

1 材料与方法

试验于2017年在福建农林大学蜂学学院蜜蜂保护实验室完成。

1.1 生物材料

意蜂工蜂取自福建农林大学蜂学学院教学蜂场。

1.2 测序样品及全转录组数据来源

笔者所在课题组前期已利用二代测序技术对意蜂工蜂中肠进行深度测序，获得了高质量的全转录组数据[25]。其中，测序样品的制备过程简述如下：从外观健康且群势较强的意蜂蜂群中选择蜂子状况良好的封盖子脾，迅速提至实验室，放入（34±0.5）℃培养箱，将刚出房的工蜂（记为0 d）放入四周打孔的干净塑料盒（10只/盒），每个塑料盒上方插入一支装有50%（w/v）无菌糖水的饲喂器。（34±0.5）℃饲养工蜂至10 d。每日检查工蜂存活情况，及时清理死亡工蜂。进行3次生物学重复。待意蜂工蜂7日龄和10日龄时，在超净台用干净镊子拉取工蜂中肠，放入RNA-Free的EP管，经液氮速冻后迅速转移至-80℃超低温冰箱保存备用。意蜂7日龄工蜂中肠样品的3个重复为Am7-1、Am7-2和Am7-3；意蜂10日龄工蜂中肠样品的3个重复为Am10-1、Am10-2和Am10-3。

上述6个中肠样品的全转录组测序由广州基迪奥生物科技有限公司完成，测序平台为Illumina HiSeq 4000，测序策略为双端（paired-end）测序，测序数据已上传NCBI SRA数据库，BioProject号：PRJNA406998。cDNA建库过程简述如下：利用RNA抽提试剂盒AxyPrepTMMultisource Total RNA Miniprep Kit（TaKaRa公司，中国）抽提蜜蜂中肠样品的总RNA，为最大限度地保留所有非编码RNA（ncRNA），去除核糖体RNA后的mRNA和ncRNA用裂解缓冲液随机打断为小片段，作为模板用六碱基随机引物、缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第2链；经过QiaQuick PCR试剂盒（Qiagen公司，德国）纯化并加EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，然后通过尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）降解cDNA第2链。

1.3 测序数据质控及circRNA预测

对于测序得到的原始读段（raw reads），去除N的比例大于10%的、质量值Q≤10的和碱基数占整条读段数的50%以上的读段，过滤得到的有效读段（clean reads）用于后续的数据分析。利用TopHat软件[26]将各中肠样品的有效读段与西方蜜蜂参考基因组（Amel_4.5）[27]进行比对，从比对结果中提取未比对上读段（unmapped reads），然后截取每一条未比对上读段的两端（默认20 nt），得到短序列读段（anchors reads），继而再次比对参考基因组，将得到的比对结果提交给find_circ软件[11]，从而对circRNA进行筛选和鉴定，筛选条件包括：（1）breakpoints=1，即只保留有且只有1个清晰breakpoint的环状RNA；（2）anchor overlap≤2，即每条reads的两个anchors reads比对到基因组上的位置overlap不能超过2 bp；（3）edit≤2，即只允许2 bp错配；（4）n uniq＞2，即uniq reads大于2条；（5）best qual A＞35或best qual B＞35，即每条reads的其中一个anchors reads比对到基因组上最好的mapping结果要比其排第二的结果的分值高35分以上；（6）n uniq＞int (samples/2)，即支持该circRNA的uniq reads要大于总样品数的1/2；（7）circRNA的长度小于100 kb。

1.4 CircRNA的表达量、差异表达及来源基因分析

采用RPM（mapped back-splicing junction reads per million mapped reads）法计算circRNA的表达量。先计算Am7和Am10中所有circRNA的lg (RPM+1)值，再利用基迪奥在线工具平台Omicshare（www. omicshare.com/tools）绘制Am7和Am10的circRNA的箱线图，从而比较二者的circRNA的表达量，参数为默认参数。利用DEGseq软件[28]对circRNA进行差异表达分析，DEcircRNA的筛选条件包括：（1）差异倍数（fold change，FC）≥2；（2）＜0.05；（3）错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05。来源于内含子或由内含子和外显子环化的circRNA能够调节亲本基因的表达[22,29]，使用短reads比对工具Bowtie[30]分别将这些circRNA两端的anchors reads比对西方蜜蜂参考基因组[27]，两端都比对上同一个基因即为该circRNA的来源基因，再将来源基因通过BLAST注释到GO和KEGG数据库，按照值≤0.5筛选显著富集GO条目或KEGG代谢通路的DEcircRNA的来源基因注释。

1.5 DEcircRNA的靶miRNA预测及调控网络构建

利用TargetFinder软件[31]预测DEcircRNA靶向结合的miRNA，得到DEcircRNA-miRNA的靶向调控关系。按照≤0.05，自由能≤35的标准，从结果中提取DEcircRNA潜在的靶向结合miRNA的位点信息。进一步预测DEcircRNA的靶miRNA靶向结合的mRNA，根据DEcircRNA与靶miRNA、miRNA与靶mRNA的结合关系，得到DEcircRNA-miRNA-mRNA的靶向调控关系，最后通过Cytoscape v.3.2.1软件[32]对各调控网络进行可视化，参数采用默认参数。

1.6 DEcircRNA的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证

为了验证circRNA-seq数据的可靠性，随机选取6个DEcircRNA（novel_circ_000663、novel_circ_005547、novel_circ_014049、novel_circ_002507、novel_circ_ 012440及novel_circ_001915）进行RT-qPCR验证。参照GUO等[16]的方法，利用DNAMAN软件根据所选circRNA的碱基序列设计相应的特异性反向引物，委托上海生工生物工程有限公司进行合成，相关引物信息详见表1。利用RNA抽提试剂盒（TaKaRa公司，中国）分别提取Am7和Am10样品的总RNA，分为两份，其中一份总RNA用3 U/mg RNase R（吉赛生物公司，中国）进行消化以去除线性RNA，37℃处理15 min后以随机引物进行反转录，得到circRNA的cDNA；另一份总RNA直接作为模板，以Oligo (dT)23作为引物进行反转录，得到所有含polyA的RNA对应的cDNA，作为内参基因的qPCR模板[33]。反应体系（20 μL）包含正、反向引物（10.0 μmol·L-1）各1 μL，cDNA模板DNA 1 μL，SYBR Green Dye 10 μL，DEPC水7 μL。反应在QuantStudio荧光定量PCR仪（ThermoFisher公司，美国）上进行，按照SYBR Green Dye试剂盒（Vazyme公司，中国）操作说明书上的方法，每个反应进行3次重复。反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，60℃延伸30 s，共45个循环，最后72℃延伸45 s。利用2−ΔΔCt法对上述DEcircRNAs的相对表达量进行计算。通过Graph Prism软件进行相关数据分析及绘图。

表1 RT-qPCR验证的引物信息

2 结果

2.1 高通量测序数据的质控及评估

前期研究中的意蜂工蜂中肠样品Am7及Am10测序分别得到134 802 058条raw reads，经过滤得到clean reads数平均为147 051 470条，各样品的平均Q20和Q30分别为97.34%和93.86%[25]。此外，Am7与Am10的组内Pearson相关系数都≥0.950（图1）。上述结果表明本研究中的测序数据质量良好，可用于下一步分析。本研究中，各样品的anchors reads平均为181 583 825条，比对上参考基因组的anchors reads数平均为19 616 356条（表2）。

表2 未比对上核糖体数据库的有效读段比对参考基因组的信息统计

2.2 意蜂工蜂中肠circRNA的表达谱分析

对Am7和Am10中所有circRNA进行表达量分析，结果显示前者中的circRNA的整体表达水平较高（图2-A）。Am7中表达量最高的circRNA为novel_ circ_003183、novel_circ_010717、novel_circ_012530、novel_circ_000476及novel_circ_011750（表3）；Am10中表达量最高的circRNA为novel_circ_003183、novel_ circ_010717、novel_circ_012530、novel_circ_000896、novel_circ_000476（表4）。进一步分析发现，novel_ circ_003183、novel_circ_010717、novel_circ_012530及novel_circ_000476在Am7和Am10中均高量表达，推测它们在意蜂工蜂中肠的发育过程中发挥重要作用。Novel_circ_009675和novel_circ_013879分别在Am7和Am10中高量表达，推测二者分别在意蜂工蜂中肠发育的不同时期发挥特殊功能。差异分析结果显示，Am7 vs Am10中共有256个DEcircRNA，包含105个上调和151个下调circRNA（图2-B）。

2.3 意蜂工蜂中肠DEcircRNA来源基因的GO数据库注释

GO分类结果显示，Am7 vs Am10的DEcircRNA来源基因可注释到32个GO条目（term），涉及细胞组分、生物学进程和分子功能3大功能分类（图3）。细胞组分中，注释基因数最多的前5位分别是细胞（21个）、细胞组件（21个）、细胞膜组件（15个）、细胞膜（15个）及细胞器（15个）；生物学进程中，注释基因数最多的前5位分别是单组织进程（38个）、细胞进程（38个）、代谢进程（35个）、定位（13个）及生物调控（10个），此外应激反应和发育进程注释基因数分别为7和2个；分子功能中，注释基因数最多的前5位分别是结合（50个）、催化活性（35个）、转运器活性（8个）、核苷酸结合转录因子活性（4个）及分子传感器活性（3个）。上述结果说明DEcircRNA在意蜂工蜂中肠的生长、发育、代谢、免疫和细胞生命活动中发挥功能。

图1 各意蜂工蜂中肠样品的不同生物学重复间的Pearson相关性

A：Am7和Am10中circRNA表达量的箱线图Box plot of the circRNAs’ expression quantity in Am7 and Am10；B：Am7 vs Am10中的DEcircRNA DEcircRNAs in Am7 vs Am10

表3 Am7样品中表达量最高的前10位circRNA

图3 DEcircRNA来源基因的GO数据库注释

2.4 意蜂工蜂中肠DEcircRNA来源基因的KEGG数据库注释

KEGG数据库注释结果显示（图4），意蜂工蜂中肠DEcircRNA的来源基因可注释到35条代谢通路（pathway），其中注释基因数最多的前10位分别是Hippo信号通路（5个，图5-A）、内吞作用（5个，图5-B）、吞噬体（4个）、FoxO信号通路（3个）、mRNA监测通路（3个）、溶酶体（3个）、RNA转导（3个）、背腹轴形成（2个）、淀粉和蔗糖代谢（2个）及半乳糖代谢（2个），说明DEcircRNA通过参与多条信号通路、免疫通路对意蜂工蜂中肠的生长发育、免疫防御进行调节。内吞作用、Hippo信号通路的概貌详见图5-A和图5-B。

2.5 意蜂工蜂中肠的DEcircRNA-miRNA、DEcircRNA- ame-miR-6001-3p-mRNA调控网络构建及分析

通过TargetFinder和Cytoscape软件构建及可视化意蜂工蜂中肠的DEcircRNA-miRNA调控网络，88个上调circRNA靶向结合71个miRNA，其中novel_ circ_011577、novel_circ_010719及novel_circ_ 009951结合的miRNA数最多，分别为32、28和18个；53个下调circRNA可靶向结合36个miRNA，其中novel_ circ_013731、novel_circ_002319及novel_circ_006352结合的miRNA数最多，分别为23、6和5个。多数DEcircRNA（70.21%）仅能结合1—2个miRNA。此外，mir-136-y、ame-miR-6001-3p及mir-136-y结合的circRNA数最多，分别为15、14和14个circRNA（图6）。影响miRNA与靶基因的结合，从而对下游的基因表达进行间接调控。进一步构建DEcircRNA-ame- miR-6001-3p-mRNA的调控网络（图7），分析结果显示共有14个DEcircRNA（novel_circ_011733、novel_circ_001055、novel_circ_000661、novel_circ_ 002196、novel_circ_014839、novel_circ_000663、novel_ circ_005547、novel_circ_010719、novel_circ_006612、novel_circ_004676、novel_circ_006035、novel_circ_ 002507、novel_circ_014049及novel_circ_010227）靶向结合同一个miRNA（ame-miR-6001-3p），说明这些DEcircRNA可通过竞争性结合ame-miR-6001-3p而抑制其与靶基因的结合，从而影响靶基因的表达水平。上述结果说明意蜂工蜂中肠发育过程中DEcircRNA通过作为ceRNA充当miRNA的海绵，间接调控基因表达。

表4 Am10中表达量最高的前10位circRNA

圆圈大小代表富集在某一通路的基因数多少，越大代表基因数越多；圆圈颜色代表某一通路的富集基因的显著性高低，越红代表显著性越高

红色方框代表注释在该通路的DEcircRNA的来源基因Red boxes indicate DEcircRNAs’ source genes annotated in certain pathway

图6 意蜂工蜂中肠的DEcircRNA-miRNA调控网络

图7 意蜂工蜂中肠的DEcircRNA-ame-miR-6001-3p-mRNA调控网络

2.6 DEcircRNA的RT-qPCR验证

随机挑取6个DEcircRNA进行RT-qPCR验证，结果显示其中5个DEcircRNA的表达量变化趋势和转录组数据的结果一致（图8），说明本研究中的测序数据真实可靠。

3 讨论

CircRNA在可变剪接、转录调控和来源基因的表达调控等方面具有重要功能[6]。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，人们已在人类[10-12]、牛[34]、猪[35]、鸡[36]、老鼠[37]、斑马鱼[13]、草鱼[38]、水稻[14]、大麦[39]、拟南芥[40]、线虫[41]、蜜蜂球囊菌[16]、古细菌[15]和丁型肝炎病毒[8]等动植物及微生物中预测和鉴定出circRNA。2018年，CHEN等[19]通过高通量测序技术和生物信息学方法从西方蜜蜂蜂王的卵巢组织中预测出12 211个circRNA，这是迄今唯一有关蜜蜂circRNA的研究报道。前期研究中，笔者通过对意蜂7和10日龄工蜂中肠进行全转录组测序和全面分析，提供了中肠发育过程中lncRNA的表达谱及差异表达信息，构建并分析了差异表达lncRNA（DElncRNA）的调控网络，在组学水平揭示了DElncRNA在意蜂工蜂中肠发育过程中的作用[25]。本研究在此基础上，进一步通过生物信息学方法对意蜂工蜂中肠的circRNA进行挖掘，从意蜂7和10日龄工蜂中肠中分别预测出7 341和9 092个circRNA，为蜜蜂的ncRNA信息提供了重要补充。

本研究发现，novel_circ_003183、novel_circ_010717、novel_circ_012530、novel_circ_000896、novel_circ_ 000476、novel_circ_011750、novel_circ_011749、novel_ circ_006484、novel_circ_012115及novel_circ_009675在Am7和Am10中皆高量表达，说明它们在意蜂中肠发育过程中具有重要功能，但它们是否在其他日龄的意蜂工蜂中肠中高量表达，有待于进一步研究。Novel_circ_009675和novel_circ_013879分别在Am7和Am10中高量表达，二者在意蜂中肠发育的不同时期发挥特殊功能。Am7 vs Am10中包含105个上调和151个下调circRNA，推测这些DEcircRNA与意蜂中肠发育关系密切。

RT-qPCR组中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01 In RT-qPCR group, * indicates p＜0.05, ** indicates p＜0.01

来源于外显子和内含子组成的circRNA（exon- intron circRNA，EIciRNA）可通过与RNA聚合酶II、U1小核核糖核蛋白及基因启动子相互作用对其来源基因的转录进行调控[29]。蜜蜂的天然食物主要包括含葡萄糖、果糖和淀粉等成分的蜂蜜及含蛋白质的花粉[42]。蜜蜂中肠作为主要的消化和吸收器官，含有大量的消化酶如淀粉酶、蔗糖酶和蛋白酶等[43]。本研究中，DEcircRNA的来源基因中有35个可注释到催化活性；分别有1、2和2个来源基因可注释到磷酸肌醇代谢、淀粉和蔗糖代谢和半乳糖代谢等消化吸收相关通路。上述结果表明相应的DEcircRNA参与意蜂工蜂中肠的食物消化、营养吸收等过程。此外，分别有2和35个来源基因注释到发育进程和代谢进程，暗示DEcircRNA在此过程扮演重要角色。Hippo信号通路可通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡对器官大小进行调节[44]，也能和其他信号通路相互作用共同调节肠道组织的稳态[45]，还在肠道结构的维持特别是上皮细胞的分化过程起重要作用[46]。Wnt信号通路与哺乳动物胚胎形成、卵巢发育、平面细胞极化等生理学进程密切相关[47]，还能够与Hippo、Notch和TGF-beta信号通路共同影响昆虫的体节形成、色素沉淀、附肢发育以及翅等器官的发育[48]。本研究发现，分别有5和2个来源基因注释到Hippo和Wnt信号通路，表明相应的DEcircRNA可能通过调节Hippo和Wnt信号通路对意蜂工蜂中肠的细胞生长、分化及凋亡以及结构和稳态维持进行调控。还发现有7个来源基因注释到应激反应，表明相应的DEcircRNA参与调控意蜂工蜂中肠对外界环境的适应过程。

蜜蜂的免疫系统包括群体免疫与个体免疫，后者又分为细胞免疫和体液免疫。其中，蜜蜂的细胞免疫包括内吞作用、吞噬作用、黑化作用等，体液免疫主要为抗菌肽的合成与释放[49]。MAPK信号通路能够通过产生免疫效应因子刺激淋巴细胞活性，对外界入侵的病原微生物进行免疫防御[50]。本研究中，对于意蜂工蜂中肠发育过程中DEcircRNA的来源基因，分别有5、4、3和1个注释到内吞作用、吞噬体、溶酶体和泛素介导的蛋白水解等细胞免疫通路，仅有1个注释在MAPK信号通路。上述结果表明相应的DEcircRNA参与意蜂工蜂中肠的细胞免疫、体液免疫的调控过程，并且可能在细胞免疫调控方面发挥更重要的作用。

2011年，Salmena等[51]提出了“竞争性内源RNA”假说，即任何包含miRNA反应元件（miRNA response element）的RNA，例如mRNA、假基因、lncRNA和circRNA，可以竞争性地结合miRNA。此后，越来越多的研究结果都证实了ceRNA假 说[20-22,52-54]。Deng等[52]通过对患急性心肌梗塞病人和正常人的DEcircRNA进行分析，发现circRNA_081881能够靶向结合miR-548，使急性心肌梗塞相关的表达量上调；Xu等[53]分别比较分析了患恶性肿瘤的组织和正常组织的DEcircRNA，发现hsa_circ_000984通过靶向结合miR-106b，有效上调细胞生长调节相关基因的表达水平。本研究中，调控网络分析结果显示141个DEcircRNA可靶向结合107个miRNA，其中大部分DEcircRNA（70.21%）仅能结合1—2个miRNA，少数DEcircRNA可结合多个miRNA，例如novel_circ_011577和novel_circ_010719结合的miRNA数可达32和28个，表明二者作为ceRNA的重要性。还发现多个DEcircRNA可共同靶向结合同一个miRNA，例如分别有15和14个DEcircRNA共同结合mir-136-y和ame-miR-6001-3p。上述结果表明DEcircRNA可作为ceRNA吸附结合miRNA，减少其对mRNA的抑制和降解，从而影响意蜂工蜂肠道的生长发育。目前，circRNA的功能研究尚处起步阶段，绝大多数circRNA的功能还不明确。Liu等[54]通过对骨关节炎相关circRNA的深入研究，发现CircRNA-CER可通过吸附mir-136对的表达进行调控，从而参与软骨细胞外基质（EMC）的降解。本研究中，novel_circ_000976、novel_circ_005547和novel_circ_006344等23个DEcircRNA靶向结合的mir-136-y和mir-136-x与mir-136具有高度同源性，推测相应的DEcircRNA可能通过对mir-136-y、mir-136-x表达水平的调节，参与意蜂工蜂中肠细胞外基质的降解。蜕皮激素主要调控昆虫幼虫老旧组织的程序化细胞死亡与成虫干细胞的分裂分化[55]，Mello等[56]通过敲除变态发育过程中的蜜蜂个体蜕皮激素受体编码基因，发现ame-miR-6001-3p在敲除个体中上调表达，表明ame-miR-6001-3p能够抑制蜕皮激素的分泌，从而影响中肠干细胞的分裂和分化。本研究中，DEcircRNA-ame-miR-6001-3p-mRNA调控网络分析结果显示，共有novel_circ_000661、novel_circ_000663和novel_circ_001055等14个DEcircRNA能够共同靶向结合ame-miR-6001-3p，推测上述DEcircRNA可通过竞争性结合ame-miR-6001-3p调控蜕皮激素受体编码基因的表达，从而影响中肠干细胞的分裂及分化。进一步通过设计跨反向剪切位点的引物对随机挑选DEcircRNA进行RT-qPCR验证，结果显示83.33%（5/6）的DEcircRNA相对表达量与测序结果一致，证实了本研究中circRNA差异表达信息的可靠性。

本研究仅对意蜂7和10日龄工蜂中肠的circRNA进行相关分析，预测出的circRNA在其他日龄工蜂中肠、同一日龄的不同组织是否表达以及表达水平的高低仍需要进一步研究。此外，若要全面解析意蜂工蜂中肠的发育机理及调控机制，则需对更多日龄的工蜂中肠进行测序，进而在全局水平进行更加深入的分析，此为下一步的工作重点。

4 结论

通过对意蜂7和10日龄工蜂中肠的深度测序和生物信息学分析，提供了中肠发育过程的circRNA表达谱及差异表达信息。DEcircRNA可能通过调控来源基因的表达水平和作为ceRNA在意蜂工蜂中肠发育过程中发挥重要功能。靶向结合ame-miR-6001-3p的14个DEcircRNA可能参与意蜂中肠干细胞的分裂及分化。

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Analysis of differentially expressed circular RNAs and their regulation networks during the developmental process ofworker’s midgut

GUO Rui, CHEN HuaZhi, XIONG CuiLing, ZHENG YanZhen, FU ZhongMin, XU GuoJun, DU Yu, WANG HaiPeng, GENG SiHai, ZHOU DingDing, LIU SiYa, CHEN DaFu

(College of Bee Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002)

【Objective】Circular RNA (circRNA) plays a primary role in alternative splicing, transcription regulation and expression regulation of parental gene. The objective of this study is to investigate the profile expression of circRNAs and differentially expressed circRNAs (DEcircRNAs) during the developmental process of the midguts ofworkers, and to explore the role of DEcircRNAs in the development of midgut at the transcriptional level. 【Method】 On basis of the whole transcriptome data from 7- and 10-day-old worker’s midguts of(Am7 and Am10), find_circ software was used to predict circRNAs based on the filtered sequencing data.The circRNA expression level was normalized by RPM algorithm. Differential expression analysis for circRNAs was conducted via DEGseq software following standards fold change≥2.0,＜0.05 and false discovery rate (FDR)＜0.05. Source genes of DEcircRNAs were annotated to GO and KEGG databases to gain function and pathway annotations by using BLAST. DEcircRNAs-miRNAs and DEcircRNAs-miRNAs-mRNAs networks were predicted with TargetFinder software and visualized using Cytoscape v.3.2.1 software. RT-qPCR was conducted to verify the reliability of sequencing data.【Result】 On average, 19 616 356 anchors reads were obtained from eachworker’s midgut sample.Pearson correlations between different biological repeats within Am7 and Am10 groups were ≥0.950. In total, 256 DEcircRNAs including 105 up-regulated circRNAs and 151 down-regulated circRNAs were predicted. Novel_circ_009675 and novel_circ_013879 were highly expressed in Am7 and Am10, respectively. Source genes of DEcircRNAs could be annotated to 32 GO terms including binding, single-organism process and cellular process, among them 35, 35 and 7 source genes were involved in catalytic activity, metabolic process and stress response. Additionally, these source genes could be annotated to 35 KEGG pathways, in which 5, 5 and 4 source genes were associated with Hippo signaling pathway, endocytosis and phagosome, respectively; further investigation showed that 1, 2 and 2 source genes could be annotated to material metabolisms such as phosphoinositol metabolism, starch and sucrose metabolism and galactose metabolism; 5, 4, 3, 1 and 1 source genes could be annotated to immune signaling pathways including endocytosis, phagosome, lysosome, ubiquitin-mediated proteolysis and MAPK signaling pathway, respectively.These results suggested that the corresponding DEcircRNA was involved in the development, metabolism and immune defense of the midgut of.DEcircRNA-miRNA regulation network analysis showed that 141 DEcircRNAs could link to 107 miRNAs, most of these DEcircRNAs could only bind to 1-2 miRNAs, but novel_circ_011577 and novel_circ_010719 could respectively bind to 32 and 28 miRNAs.In addition, the number of DEcircRNAs combined with mir-136-y, ame-miR-6001-3p and mir-136-y was the highest (15, 14 and 14, respectively), which indicated that the corresponding DEcircRNA could play roles during the developmental process ofworker’s midgut as competing endogenous RNAs. Furthermore, DEcircRNAs-ame-miR-6001-3p-mRNA network was constructed and analyzed, and the result indicated that 14 DEcircRNAs could jointly link to ame-miR-6001-3p, implying they were likely to indirectly regulate division and differentiation of stem cells inworker’s midgut via regulation of ame-miR-6001-3pSix DEcircRNAs were randomly selected for RT-qPCR assay, the result showed the alteration trend of expression levels of 5 DEcircRNAs was consistent with that of the sequencing data, which proved the reliability of trancriptome data.【Conclusion】Through the deep investigation of DEcircRNAs during the developmental process ofworker’s midgut, the expression profile and differential expression information of circRNAs in the development of midgut of worker bee were provided, and the role of DEcircRNAs in the development of midgut was revealed. It provides a basis for the screening and functional study of key circRNAs associated with the development of the midgut.

; midgut; circRNAs; regulation network; development

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.23.015

2018-07-16；

2018-09-10

国家现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-44-KXJ7）、福建省科技计划项目（2018J05042）、福建省教育厅中青年教师教育科研项目（JAT170158）、福建农林大学科技创新专项基金（CXZX2017342，CXZX2017343）、福建省大学生创新创业训练计划（3165602032，3155006018）

郭睿，E-mail：ruiguo@fafu.edu.cn。陈华枝，E-mail：18965015689@163.com。郭睿和陈华枝为同等贡献作者。

陈大福，E-mail：dfchen826@fafu.edu.cn

（责任编辑 岳梅）