黄花蒿提取物对奶牛瘤胃发酵指标的影响

王丽芳，斯琴毕力格，敖长金



黄花蒿提取物对奶牛瘤胃发酵指标的影响

王丽芳1，斯琴毕力格2，敖长金2

（1内蒙古自治区农牧业科学院，呼和浩特 010031；2内蒙古农业大学，呼和浩特 010018）

【目的】在奶牛日粮中添加菊科植物黄花蒿乙醇提取物，研究其对瘤胃中乙酸、丙酸、丁酸等发酵指标的影响，进一步探讨其对CLA合成的溶纤维丁酸弧菌()和蛋白溶解梭菌()的影响，旨在阐明黄花蒿乙醇提取物对奶牛瘤胃发酵的作用，并从瘤胃层次探明其对牛奶中CLA合成的部分作用机制。【方法】选取15头体重为(600±29)kg、胎次2-3、泌乳期(158±3)d及泌乳量(22.8±1.8)kg·d-1相近的荷斯坦奶牛为试验动物，试验牛统一管理，自由采食、自由饮水；每天饲喂2次、挤奶2次（早上4:30、下午16:30）。试验采用完全随机设计，分为3组，分别是对照组和2个试验组，每组5头牛。试验1组黄花蒿乙醇提取物的添加量为96 g/（d·头），试验2组黄花蒿乙醇提取物的添加量为160 g/（d·头）。试验期40 d，前9 d为预饲期，10—40 d为正式期。【结果】奶牛日粮中添加黄花蒿乙醇提取物可以增加瘤胃中pH值，其中两个试验组pH值分别增加了2.63%和8.61%，但差异不显著(＞0.05)；添加黄花蒿乙醇提取物均降低了瘤胃中VFA的含量，除异戊酸和戊酸低剂量黄花蒿乙醇提取物与对照组差异不显著外，其余各组乙酸、丙酸、丁酸均与对照组差异显著(＜0.05)。添加黄花蒿乙醇提取物均增加了瘤胃液相和瘤胃液混合物中的相对百分比，差异显著(＜0.05)；降低了瘤胃固相中的相对百分比，差异不显著(＞0.05)。添加黄花蒿乙醇提取物均降低了瘤胃液相和瘤胃固相中的相对百分比，差异显著(＜0.05)，增加了瘤胃液混合物中的相对百分比，但是差异不显著(＞0.05)。【结论】奶牛日粮中添加黄花蒿乙醇提取物影响瘤胃发酵，对瘤胃不同内容物中和影响不同，总体趋势是增加瘤胃中的相对百分比，降低瘤胃中的相对百分比，有利于调控CLA的生成。

黄花蒿乙醇提取物；奶牛；瘤胃；溶纤维丁酸弧菌；蛋白溶解梭菌

0 引言

【研究意义】共轭亚油酸（CLA）是一组含有共轭双键的亚油酸（linoleic acid）的几何异构体和位置异构体的总称[1-2]，cis-9、trans-11-CLA被认为是CLA的最主要的活性形式，俗名瘤胃酸，占牛奶中总CLA的80%—90%[3]。CLA具有抗癌、抗糖尿病、减少脂肪沉积和动脉硬化、改变营养分配及调节免疫系统等生物学作用[4-8]。因此，增加乳中cis-9、trans-11-CLA含量成为动物营养学领域的研究热点。【前人研究进展】国内外很多学者对增加乳中CLA含量开展了大量研究。研究表明，奶牛日粮中分别添加富含亚油酸及亚麻酸的日粮及浸提的油料籽实和豆油可以增加牛奶中CLA含量[9]，添加鱼油可以提高牛奶中CLA含量[10]，体外试验表明，稀释率、pH值及鱼油和葵花油对CLA含量有显著影响[11]，在体外试验亚油酸C18:2存在的条件下，添加离子载体（尼日利亚菌素，莫能菌素和替曲那新）减少了亚油酸的完全氢化，增加了200%的cis-9，trans-11-CLA[12]，奶牛釆食含有菊科植物的牧草或其提取物可以增加牛奶和羊奶中CLA含量[13-16]。【本研究切入点】多数研究主要集中于如何增加牛奶中CLA的含量，但是对于影响CLA合成的作用机制研究相对较少，特别是对于植物提取物调控牛奶中CLA含量的作用机制研究较少。【拟解决的关键问题】本研究通过在奶牛日粮中添加菊科植物黄花蒿乙醇提取物，研究其对瘤胃中影响CLA合成的溶纤维丁酸弧菌（）和蛋白溶解梭菌（）的影响，同时探讨对奶牛瘤胃中挥发性脂肪酸和pH值的影响，旨在从瘤胃层次探明黄花蒿乙醇提取物对牛奶中CLA合成的部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

试验于2016年9月5日至10月15日在内蒙古呼和浩特市赛罕区章盖营牧场进行，试验期40 d，前9 d为预饲期，10—40 d为正式期。

1.2 试验材料

1.2.1 试验动物及饲养管理 选取15头体重为（600±29）kg、胎次（2—3）、泌乳期（158±3）d及泌乳量（22.8±1.8）kg·d-1相近的荷斯坦奶牛为试验动物。试验牛统一管理，自由采食、自由饮水；每天饲喂2次、挤奶2次（早上4：30、下午4：30）。

1.2.2 试验日粮 试验所用精饲料和粗饲料均来自呼和浩特市赛罕区章盖营牧场，粗饲料由苜蓿、羊草、玉米青贮和谷草组成，基础日粮组成及营养水平见表1。

1.2.3 黄花蒿乙醇提取物 黄花蒿乙醇提取物购于南京泽朗公司，提取工艺条件是：乙醇浓度55%，提取温度95℃，提取2 h。GC-MS和LC-MS分析的黄花蒿乙醇提取物活性成分主要包括：倍半萜类35%、芳香族类29%、脂肪酸类6%、甾体类6%、三萜类6%、脂肪族类4%、生物碱类3%、酚类5%、杂环类2%、其他4%（GC-MS）；黄酮类和萜类（LC-MS）。

表1 基础饲粮组成及营养水平（干物质基础）

1.3 试验设计

试验采用完全随机设计，分为3组，分别是对照组和2个试验组，每组5头牛。试验1组黄花蒿乙醇提取物的添加量为96 g/（d·头），试验2组黄花蒿乙醇提取物的添加量为160 g/（d·头）[16]，每天饲喂两次，饲喂时黄花蒿乙醇提取物先与200g精饲料混合均匀让奶牛釆食完再饲喂TMR饲料。前9 d为预饲期，10—40 d为正式期，试验期共40 d。

1.4 测定指标

溶纤维丁酸弧菌、蛋白溶解梭菌、瘤胃总菌Total bacteria、pH值、VFA。

正式试验期最后一天，每组随机选取3头牛，通过口腔采集瘤胃液，4层纱布过滤后直接测pH值；过滤后的瘤胃液取5 ml加入预先装有1 mL 25%偏磷的离心管中，摇匀，置于-20℃冰箱中冷冻保存待测VFA；分别取过滤后的瘤胃液相、瘤胃固相及瘤胃液全混合物分装于5 mL冻存管，所有样品置于液氮中冷冻保存备测3种细菌。

1.4.1 细菌基因组DNA的提取 DNA提取参照QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒说明书操作。并利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的细菌基因组DNA的质量。

1.4.2 标准质粒的制备 分别采用这3种细菌的特异性引物，同时以瘤胃内容物基因组DNA为模板，PCR扩增其特异性片段，利用胶回收试剂盒（AXYGEN，USA）回收产物，并连接pMD18-T载体（Takara，Japan），转化入感受态细胞。菌落PCR鉴定阳性克隆子测序鉴定。根据测序结果，利用质粒提取试剂盒（AXYGEN，USA）提取含有目的片段的标准质粒，并利用Qubit 3.0（Invitrogen，USA）测定质粒DNA溶液浓度，计算标准质粒的拷贝数。

1.4.3 标准曲线的制备 把标准质粒DNA进行10倍梯度系列稀释制作标准样品和待测样品一起扩增，得出标准曲线，根据所得标准曲线计算出样品中的基因拷贝数，最后以基因拷贝数每μL为单位进行分析。

1.4.4 荧光定量 本研究通过荧光定量的方法对3种菌的基因进行定量。基因引物序列见表2，引物浓度均为10 mmol·L-1。qPCR反应在专用的PCR八连管（Axygen, USA）中进行，25 μL体系，反应体系见表3。所有样品做3个重复，使用Takara试剂盒。RT-PCR 的反应程序为：95℃变性10 min，在95℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40次，荧光数据采集在延伸时进行。实时定量PCR在FTC-3000荧光定量PCR仪中进行。

表2 瘤胃氢化菌PCR的引物序列

F和R分别代表上、下游引物 F and R indicates forward and reverse primers, respectively

表3 PCR体系

1.4.5的计算（%）=/ Total bacteria×100%；

的计算：（%）=/ Total bacteria×100%。

1.4.6 VFA测定 参照文献[17]方法测定VFA含量。

1.5 数据处理

试验数据采用Excel2007初步整理后，采用SAS 9.2进行方差分析（ANOVA），采用DUNCAN法进行多重比较，＜0.05 作为差异显著的判断标准。

2 结果

2.1 对瘤胃pH值和VFA的影响

从表4可以看出，与对照组相比，奶牛日粮中添加黄花蒿乙醇提取物可以增加瘤胃中pH值，其中两个试验组pH值分别增加了2.63%和8.61%，但差异不显著（＞0.05）；添加黄花蒿乙醇提取物均降低了瘤胃中VFA的含量，除异戊酸和戊酸低剂量黄花蒿乙醇提取物与对照组差异不显著外，其余各组VFA均与对照组差异显著（＜0.05）。其中两个试验组乙酸含量分别降低了36.27%和57.25%，丙酸含量分别降低了28.01%和45.81%，丁酸含量分别降低了17.86%和42.86%，异戊酸含量分别降低了23.35%和52.10%，戊酸含量分别降低了5%和50%，且VFA降低与黄花蒿乙醇提取物添加量呈剂量效应关系。

2.2 对瘤胃中溶纤维丁酸弧菌的影响

从表5可以看出，与对照组相比，奶牛日粮中添加黄花蒿乙醇提取物均增加了瘤胃液相和瘤胃液混合物中的相对百分比，两个试验组分别增加了瘤胃液相中37.04%和40.74%，增加了瘤胃液混合物中83.3%和55.56%，差异显著（＜0.05）；降低了瘤胃固相中的相对百分比，与对照组相比，两个试验组的相对百分比分别降低了12.5%和18.75%，但是差异不显著（＞0.05）。

表4 黄花蒿乙醇提取物对瘤胃内pH值和VFA的影响

同行数据不同小写字母a,b,c表示差异显著（＜0.05）。下同

In the same row, values with different small letter(a,b,c) mean significant difference(＜0.05). The same as below

表5 黄花蒿乙醇提取物对瘤胃溶纤维丁酸弧菌的影响

2.3 对瘤胃中蛋白溶解梭菌的影响

从表6可以看出，与对照组相比，奶牛日粮中添加黄花蒿乙醇提取物均降低了瘤胃液相和瘤胃固相中的相对百分比，两个试验组分别降低了瘤胃液相中5.03%和1.12%，降低了瘤胃固相中22.69%和4.20%，差异显著（＜0.05）；增加了瘤胃液混合物中的相对百分比，与对照组相比，两个试验组的相对百分比分别增加了54.49%和16.67%，其中试验1组显著高于对照组（＜0.05），试验2组与对照组差异不显著（＞0.05）。

表6 黄花蒿乙醇提取物对瘤胃蛋白溶解梭菌的影响

3 讨论

3.1 瘤胃发酵参数

VFA是瘤胃发酵的主要指标之一，是碳水化合物在瘤胃中发酵的主要产物，可提供反刍动物总能量需要的70%—80%，且VFA含量与反刍动物能量转化效率呈正相关，与pH值呈负相关。本试验结果表明，添加黄花蒿乙醇提取物显著降低了瘤胃中VFA的含量，增加了pH值，提示黄花蒿乙醇提取物可能会影响能量转化效率，影响瘤胃发酵。

本研究结果与相关研究结果不完全一致。BAYAT等[18-19]研究报道，奶牛日粮中添加荠蓝油、活酵母、肉豆蔻酸、菜籽油、红花油和亚麻油对瘤胃pH值和VFA没有显著影响；而本试验显著降低了瘤胃中VFA的含量，增加了pH值，导致这种差异的可能是因为添加物不同所致，本试验添加的是植物提取物，而上述研究中添加的是植物油等。本试验也与一些试验结果相同，王丽芳[16]研究结果表明，在奶山羊日粮中添加不同剂量的黄花蒿乙醇提取物均降低了瘤胃中乙酸、丙酸、丁酸等VFA各采样时间点的平均浓度，增加了pH平均值，与本试验结果一致，说明黄花蒿乙醇提取物对不同奶畜瘤胃发酵的影响相似。

3.2 瘤胃中B. fibrisolvens和C. proteoclasticum

反刍动物产品中 CLA 主要来源于两个途径，分别是外源途径和内源途径，外源途径就是亚油酸在瘤胃等分泌的异构化酶作用下，异构化为cis-9，trans-11-CLA，内源途径就是瘤胃不饱和脂肪酸生物氢化形成的中间产物反式油酸（trans-11-18：1，TVA）进入乳腺中，在△9-去饱和酶的作用下生成 CLA[20]，可以把TVA转化为C18:0饱和脂肪酸[21]，近来，被归类为，在现在的研究中，进一步被归类为[22]。可以看出，对 cis-9，trans-11-CLA的生成具有正调控作用，而对cis-9，trans-11-CLA的生成具有负调控作用。因此通过营养调控措施，增加瘤胃中的含量，降低的含量有利于cis-9，trans-11-CLA的生成。

本试验通过营养调控措施，对黄花蒿乙醇提取物调控cis-9，trans-11-CLA合成的两种细菌和的研究结果表明，添加黄花蒿乙醇提取物可以增加瘤胃液相和瘤胃液全混合物中的相对百分比，降低了瘤胃固相中的相对百分比。茅慧玲[23]研究报道，添加低比例杭白菊茎叶增加了瘤胃液相中的含量，降低了瘤胃固相中的含量，与本试验结果相一致；但是对于研究结果却与本试验结果不同，本试验添加黄花蒿乙醇提取物降低了瘤胃液相和瘤胃固相中的相对百分比，但增加了瘤胃液全混合物中的相对百分比，而茅慧玲[23]研究表明，添加中比例杭白菊茎叶增加了瘤胃液相中的含量，但是对瘤胃固相中的含量没有影响。导致这种差异的原因可能是这两种植物所含的活性成分不完全相同所致，杭白菊茎叶的主要活性成分是黄酮类和挥发油类物质[23]，而本试验所用黄花蒿乙醇提取物的主要活性成分除黄酮类还包括萜类和芳香族类物质。RAMOS- MORALES等[24]研究结果表明，大蒜精油中丙基丙硫代亚磺酸酯（PTS）显著增加了瘤胃液中的丰度（＜0.05），降低了的丰度（＞0.05），与本试验结果基本一致；RAMOS- MORALES等[25]通过体外试验研究表明，添加0.02 g·L-1蓖麻酸对没有影响，但降低了的含量，有助于CLA的积累，主要原因是蓖麻酸阻止了的生物氢化作用所致，与本试验结果一致。

其他一些相关研究与本研究结果也存在异同点，周薇等[26]研究表明，添加α-亚麻酸在调控CLA生成的过程中，降低了瘤胃液中和的含量，且呈剂量依赖性，而本研究的结果添加黄花蒿乙醇提取物增加了瘤胃液中的含量，与上述研究结果不一致，但是降低的含量与上述研究结果相似，但是本研究这两种菌与黄花蒿乙醇提取物没有剂量效应关系，与上述研究结果也不相符。刘仕军等[27]研究表明，添加鱼油和葵花油抑制了的生长，与本试验结果不一致。史浩亭等[28]研究表明，添加苏子油和橡胶籽油在高剂量（植物油添加量为饲料干物质含量的3%和4%）时均降低了瘤胃液中的相对百分比。RAMOS-MORALES等[29]体外试验研究表明，添加0.025 g·L-1斑鸠菊酸降低了的含量，添加0.05 g·L-1斑鸠菊酸降低了和的含量，与本试验结果不完全相同。本试验结果与以上结果不同的可能原因是添加物不同，本试验添加的是植物提取物，而以上试验添加的是植物油或脂肪酸。本试验总体趋势是增加瘤胃中的相对百分比，降低瘤胃中的相对百分比，有利于调控CLA的生成，本试验结果与项目组在奶牛饲养试验中增加牛奶中CLA含量的结果相一致[30]。

另外，目前对CLA合成的调控作用在瘤胃层次研究通常只选取瘤胃液相和固相，本研究对瘤胃液相、瘤胃固相和瘤胃液全混合物均进行了研究，结果表明，和在瘤胃不同内容物中表达量不同，这提示在未来的研究中，选择不同瘤胃内容物，结果不相一致。

4 结论

奶牛日粮中添加黄花蒿乙醇提取物影响瘤胃发酵；对瘤胃不同内容物中和影响不同，总体趋势是增加瘤胃中的相对百分比，降低瘤胃中的相对百分比，有利于调控共轭亚油酸的生成。

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The Study on Effects ofExtracts on the Rumen Fermentation in Dairy Cows

WANG LiFang1, SIQINBILIGE2, AO ChangJin2

(1Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Hohhot 010031;2Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018)

【Objective】The effects of daisy plant () extracts (AAE) on the fermentation indexes such as acetic acid, propionic acid and butyric acid in the rumen in dairy cows were studied in this paper, and furthermore the effects onandfor regulating CLA synthesis in the rumen were researched. The purpose of this study was to explore the effects of AAE on rumen fermentation in dairy cows, and to investigate the part mechanism of effecting CLA synthesis from the rumen.【Method】Fifteen dairy cows (600±29) kg, parity 2-3, in lactating (158±3) d and milk yield (22.8±1.8)kg·d-1were used in completely random design in 40 d experimentalperiods. The experimental dairy cows were integrated management, free ingestion, free drinking water, feeding 2 times per day, milking 2 times (4:30 a.m., 16:30 p.m.). The experiments groups comprised the control and two treatments (treatment one and treatment two, the doses of AAE for supplementation was 96 g·d-1and 160 g·d-1for every cow, respectively). The experimental period comprised a 9-d adaptation and a 31-d the formal period. 【Recult】The results showed as follows: ruminal pH values tended to increase in two treatments for AAE supplementation compared with the control, which increased by 2.63% and 8.61%, respectively (＞0.05). The concentrations for acetic acid, propionic acid and butyric acid decreased significantly in two treatments except forisovaleric acid and valeric acid in the low dose of AAE compared with the control (＜0.05).AAE supplementation increased the relative percentage ofin rumen mixture and rumen liquid (＜0.05), and decreased the relative percentage ofin rumen solid (＞0.05). AAE supplementation decreased the relative percentage ofin rumen liquidand rumen solid(＜0.05), and increased the relative percentage ofin rumen mixture (＞0.05). 【Conclusion】It was concluded that AAE supplementation had adverse effect on rumen fermentation characteristics, and had different effects onandon different contents of the rumen, but the general trend was increasing the relative percentage of, and decreased the relative percentage of, which ws beneficial to CLA synthesis.

extracts; dairy cows; rumen;

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.23.013

2018-02-12；

2018-06-12

国家自然科学基金（31860663）、内蒙古自治区自然科学基金（2013MS0418）、内蒙古农牧业科学院青年创新基金（2014QNJJM02）

王丽芳，Tel：13848189461；E-mail：wanglifang100008@163.com

（责任编辑 林鉴非）