表面活性素、杆菌霉素L、罗克霉素和泛革素4种脂肽类抗生素高效制备方法及其生物学活性

2018-12-11罗楚平季冬淳陈树桥陈永兴赵玉萍李相前

西南农业学报 2018年11期

罗楚平，张婧，季冬淳，陈树桥，陈永兴，赵玉萍，李相前

(1.淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏淮安 223002;2.淮阴工学院商学院，江苏淮安 223002;3.江苏省南京市水产科学研究所，江苏南京 210036)

【研究意义】脂肽类抗生物素是由短肽头部和脂肪酸尾巴组成的杂合抗生素，由于其理化性质较为稳定，具有广谱的抗菌、抗病毒［1－4］、抗肿瘤和免疫调节活性［5］，在生物技术和生物制药领域都具有广泛的应用前景。【前人研究进展】枯草芽孢杆菌及其近缘物种解淀粉芽孢杆菌都是脂肽类抗生素合成的重要微生物菌株［6］，目前报道它们能够合成分泌几十种不同结构的脂肽类抗生素，分属于表面活性素、伊枯草素、泛革素和最近发现的罗克霉素四大家簇。枯草芽胞杆菌［7］产生的脂肽类抗生素也具有丰富多样的生物活性，如表面活性素(Surfactin)不仅是表面活性剂，还具有抗癌和抗病毒的作用［8］;泛革素和杆菌霉素具有强抗真菌活性［9］;本团队最近发现的罗克霉素［10］具有强的抗细菌和抗病毒活性［11］。Zeriouh等研究表明脂肽类化合物中主要由iturins和fengycins对病原真菌起抑制作用，而surfactins有明显的抑制细菌效果［12－17］。通常一株优秀芽孢杆菌菌株能同时分泌2～3种脂肽类抗生素。在国内关于脂肽类抗生素的研究进展中，王帅等［12］发现枯草芽孢杆菌菌株G1能产生surfactin，另有研究表明B2菌株仅产 surfactin同系物、JA菌株产 iturinA同系物等［18－20］。枯草芽孢杆菌模式菌株B.subtilis 916由于sfp基因的突变不能合成脂肽类抗生素，解淀粉芽孢杆菌模式菌株B.amyloliquefaciens FZB42能够同时合成表面活性素、杆菌霉素D和泛革素三大家簇脂肽类抗生素。枯草芽胞杆菌Bs916是能同时高效分泌表面活性素、杆菌霉素L、泛革素和罗克霉素4种脂肽类抗生素的优良菌株［21］，是一种理想的制备脂肽类抗生素纯品的出发菌株。由于这4种脂肽类抗生素的理化性质相近，采用色谱技术［22－25］很难进行有效分离。【本研究切入点】本文旨在建立一种从枯草芽胞杆菌Bs916中高效简洁制备4种脂肽类抗生素的方法，初步探究制备脂肽类抗生素的生物活性。【拟解决的关键问题】建立4种脂肽类抗生素高效快速纯化方法［26－31］，检测产品的纯度，并对制备的纯化物抗真菌、抗细菌和溶血活性进行研究。为以后进一步探究脂肽类抗生素的构效关系、生物合成和开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

带有新霉素抗性基因的突变株BSBM(Δbmy)由本实验室之前构建和保存［32］。本实验采用的培养基均为LB培养基。LB培养基的配方如下:胰化蛋白胨(Tryptone)10 g/L，酵母提取物(Yeast extract)5 g/L氯化钠(NaCl)10 g/L，另外用NaOH调节该培养基的pH值至7.4。

1.2 4种脂肽类抗生素突变菌株

带有氯霉素抗性基因的泛革素操纵子(fen)突变株构建过程如下:以 FenAF(5'-TTTCTCGAGGTCTTGATGGTGCAGTCAGA-3')和FenAR(5'-TTTGAATTCCTGGACCTGTTTGTCTTTGT-3')作为引物，以Bs916的基因组DNA作为模板，PCR扩增到一条长729 bp的片段;扩增的片段经过XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切克隆至质粒载体pSG1164，构建整合质粒载体pSGFen;然后pSGFen转化至芽胞杆菌Bs916，筛选突变株BSFM(Δfen)。

带有壮观霉素抗性基因的表面活性素操纵子(srf)突变株的构建过程如下:以SpecF(5'-TTTGGATCCCTGCAGCCCTGGCGAATG-3')和SpecR(5'-TTTGAATTCAGATCCCCCTATGCAAGG-3')作为引物，以 pDG1728质粒作为模板，PCR扩增到一条长1182 bp的含有壮观霉素表达盒的片段;表达盒经Bam H I和EcoRⅠ双酶切后克隆至pUC19载体，构建为重组载体pUCSC;以SrfA-AF(5'-TTTAAGCTTACACAGATATCAGGCAAGC-3')和SrfA-AR(5'-TTTGGATCCGTCCCATCGTTCCTTCACA-3')作为引物，以Bs916的基因组DNA作为模板，PCR扩增到一条长908 bp的片段;扩增的片段经过HindⅢ 和Bam HⅠ双酶切后克隆至pUCSC，构建重组整合质粒载体pUCSCSrf;构建重组整合质粒载体pUCSCSrf转化至芽胞杆菌 Bs916，筛选突变株 BSSM( Δsrf)［33］。

1.3 脂肽类抗生素提取纯化

杆菌霉素L和表面活性素的纯化方法。枯草芽胞杆菌Bs916突变株BSFM接种至LB培养基，28℃，180 r/min，培养72 h。培养液离心除去菌体后，加盐酸调pH值至2.8，离心得到酸沉淀，甲醇抽提沉淀，然后过0.22 μM的滤膜得到杆菌霉素L和表面活性素的粗提物［34］。将粗提物用去离子水稀释成含30%甲醇水溶液，调pH值至7.0，然后上样于NH2固相萃取柱，分别用含50%甲醇水溶液，100%甲醇，含0.5%甲酸甲醇溶液，1%甲酸甲醇溶液，2%甲酸甲醇溶液梯度洗脱，在1%甲酸甲醇洗脱溶液中含有目标化合物。将含1%甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7.0，氮气吹干浓缩后用去离子水稀释为30%甲醇水溶液，然后上样于C18固相萃取柱［35］;采用 3 倍柱体积的 50%，60%，70%，80%，90%，100%甲醇水溶液梯度洗脱，其中在60%甲醇水洗脱液中得到杆菌霉素L，在100%的甲醇洗脱液中检测到表面活性素。60%甲醇水洗脱液和100%的甲醇洗脱液氮气吹干浓缩后分别得到杆菌霉素L和表面活性素的纯品。

泛革素的纯化方法。泛革素的提取方法的大体步骤如杆菌霉素L和表面活性素的纯化方法，但有以下两点不同:①泛革素提取纯化的出发菌株为突变株BSSM;②过C18固相萃取柱时，在80%的甲醇洗脱液中发现泛革素，80%的甲醇洗脱液氮气吹干浓缩后泛革素的纯品。

罗克霉素的提取纯化方法。枯草芽胞杆菌Bs916接种至LB培养基，28℃，180 r/min，培养72 h。培养液离心除去菌体后，加盐酸调至pH值至2.8，离心得到酸沉淀，甲醇抽提沉淀，然后过0.22 μM的滤膜得到罗克霉素粗提物。将粗提物采用去离子水稀释为含30%甲醇水溶液，pH值调至7.0，然后上样于NH2固相萃取柱，分别用含50%甲醇水溶液，100%甲醇，含0.5%甲酸甲醇溶液，1%甲酸甲醇溶液，2%甲酸甲醇溶液梯度洗脱，在2%甲酸甲醇洗脱溶液中含有目标化合物。将含2%甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7.0，氮气吹干浓缩后用去离子水稀释为30%甲醇水溶液，然后上样于C18固相萃取柱;采用3倍柱体积的30%，40%，50%，60%，70%，80%甲醇水溶液梯度洗脱，其中在含50%和60%甲醇水洗脱液中得到罗克霉素的提纯物。

1.4 脂肽类抗生素的HPLC-MS(高效液相色谱质谱联用)分析

采用HPLC-MS的方法定性定量检测4种脂肽类抗生素纯品。液相色谱检测条件都采用C18(5 μm;250 by 4.6 mm;VYDAC 218 TP;VYDAC，Hesperia，CA)柱;流动相为乙腈︰水︰三氟乙酸(80︰20︰0.5 vol/vol for surfactin，50 ︰50 ︰ 0.5 vol/vol for fengycin和60︰40︰0.5 for bacillomycin L);流速均为0.5 mL·min－1;紫外检测波长均为210 nm。罗克霉素(Locillomycin)的检测条件除检测波长为230 nm，其他检测条件同泛革素的检测条件。采用HPLC-MS的方法测定4种脂肽类抗生素的分子质量，使用的仪器为电喷雾条件为Agilent 6410三重串联四级杆质谱仪，测定条件为毛细管电压32 V、喷雾电压20 kV、毛细管温度320℃。

1.5 脂肽类抗生素的SDS-PAGE电泳分析

Tricine-SDS-PAGE鉴定:Tricine-SDS-PAGE参照 Schagger［36］的方法进行，分离胶浓度为 16.5%，浓缩胶浓度3%，恒压100 V电泳4 h后，以含0.25%的考马斯亮蓝的12%的醋酸进行固定和染色。对杆菌霉素L和泛革素的标准分子质量进行测定。

1.6 脂肽类抗生素的抗真菌活性和溶血活性测定

脂肽类化合物纯品抗真菌活性测定。将脂肽类化合物纯品配制成不同浓度的带毒培养基，用无菌水做对照，采用管碟法测定其对病原真菌菌丝生长的抑制作用。每组分10个处理，每处理设3个重复。于28℃培养，每12 h以十字交叉法测量1次菌落直径，取其平均值减去原菌丝块直径，连续测定1周。观察4种脂肽类化合物的纯品对病原真菌的抑制作用。在定性分析的基础上设定4种脂肽类纯化物对各个供试菌的处理浓度梯度，对具有抑制作用的病原菌进行定量分析，计算菌落抑制率。脂肽类化合物的溶血活性。在含有5% 的新鲜的绵羊血红细胞的琼脂培养基上打孔，每空滴加200 μl 1 mg/mL制备的脂肽类抗生素纯品，37℃培养1～4 d，观察空气周围的溶血透明圈，测定4种脂肽类抗生素的溶血活性。

1.7 脂肽类化合物的抑菌研究

分别取3 mL脂肽类化合物发酵培养液在10 000 r/min下离心15 min，取上清液作为抗菌粗提液。先将金黄色葡萄球在平板上涂布好，然后用灭菌镊子取灭好菌的牛津杯轻轻的放在平板的中央，用微量移液枪移取200 μl离心后的上清液加入到牛津杯中，放入30℃的恒温箱中培养，观察抑菌圈的直径大小。

2 结果与分析

2.1 脂肽类抗生素的纯化

采用构建突变株，酸沉淀，有机溶剂提取和柱层析制备了上述洗脱液氮气吹干浓缩后真空干燥，分别从10 L的发酵液中得到表面活性素纯品120 mg、杆菌霉素L纯品80 mg、罗克霉素纯品40 mg和泛革素纯品40 mg。

2.2 4种脂肽类抗生素的HPLC-MS分析

将本实验制备的表面活性素和泛革素分别与从sigma公司购买的表面活性素标准品和模式菌株解淀粉芽孢杆菌FZB42产生的泛革素标准品进行HPLC-MS比较分析，发现本实验制备的表面活性素和泛革素的纯度分别达到 98.8% 和 99.2%［37］。杆菌霉素L和罗克霉素是枯草芽孢杆菌Bs916分泌的具有独特性的2种脂肽抗生素，罗克霉素是本团队首次鉴定和报道的新型脂肽类抗生素，关于该抗生素的质谱(MS)和核磁共振(NMR)数据在前期已报道［10］，将本实验制备的罗克霉素和本实验室保存罗克霉素标准品进行HPLC-MS比较分析，其纯度也达到97.8%。然而，杆菌霉素L和泛革素纯化物的高效液相色谱检测结果都无明显的杂峰，初步推测该方法制备的杆菌霉素L和泛革素也具有较高纯度(图1～4)。

图1 高效液相色谱质谱联用分析制备的表面活性素纯品Fig.1 HPLC-MS analysis of purified surfactins

图2 高效液相色谱质谱联用分析制备的杆菌霉素L纯品Fig.2 HPLC-MS analysis of purified bacillomycin L

图3 高效液相色谱质谱联用分析制备的罗克霉素纯品Fig.3 HPLC-MS analysis of purified bocillomycin

图4 高效液相色谱质谱联用分析制备的泛革素纯品Fig.4 HPLC-MS analysis of purified fengycin

2.3 2种脂肽类抗生素的SDS-PAGE电泳分析

为进一步明确本实验室制备的杆菌霉素L和泛革素的纯度，本实验室进一步采用了Tricin-SDSPAGE电泳分析。由图5可以看出，2种脂肽类抗生素的标准分子质量根据蛋白质凝胶电泳图表明杆菌霉素和泛革素的标准分子质量约等于1 kDa，没有其他杂质的污染，纯度较高，均达到电泳纯。

2.4 4种脂肽类抗生素的溶血活性

图5 泛革素和杆菌霉素L的Tricine-SDS-PAGE电泳分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of fengycin and bacillomycin L

从图6可以看出，4种脂肽类抗生素的溶血活性测定结果表明表面活性素(Surfactin)和杆菌霉素L(Bacillomycin L)都具有较强的溶血活性，罗克霉素(Locillomycin)的溶血活性较低，泛革素(Fengycin)基本上没有溶血活性。

本结果进一步证实了枯草芽胞杆菌Bs916突变株溶血活性的变化主要是由分泌表面活性素和杆菌霉素L能力的变化引起。

2.5 4种脂肽类抗生素的抗真菌活性

从图7可以看出，4种脂肽类抗生素对西瓜枯萎病菌的毒力测定结果表明泛革素和杆菌霉素L对西瓜枯萎病菌都具有较强的抑制活性，它们IC50值都低于5 μg/mL;罗克霉素和表面活性素表现出较弱的抗真菌活性，罗克霉素的 IC50值为18 μg/mL，表面活性素的 IC50值大于 50 μg/mL。

2.6 4种脂肽类抗生素的抗细菌活性

从图8可以看出，4种脂肽类抗生素对金黄色葡萄球菌的毒力测定结果表明泛革素和杆菌霉素L对金黄色葡萄球菌抑制活性较弱，它们MIC值都高于100 μg/mL;罗克霉素和表面活性素表现出较强的抗金黄色葡萄球菌的活性，罗克霉素的MIC值为5.4 μg/mL，表面活性素的 MIC 值为8.6 μg/mL(图8)。

图6 4种脂肽类抗生素的溶血活性分析Fig.6 Hemolytic activities of the four family lipoeptides

图7 4种脂肽类抗生素的抗真菌活性分析Fig.7 Antifungal activities of the four family lipoeptides

图8 4种脂肽类抗生素的抗细菌活性分析Fig.8 Antifungal activities of the four family lipoeptides

3 讨论

自从1960年以来，仅有环脂肽(cyclic lipopeptides)和恶唑烷酮(oxazolidinones)这两类化合物以全新结构被开发进入医药市场。脂肽类抗生素除了在医疗领域展示出广阔的应用前景，由于其无毒、安全和热稳定性好的特点，在食品防腐、化妆品和农业病虫害防治等领域也展示出巨大的应用前景，是当今微生物活性产物研究的热点领域之一。芽胞杆菌是产脂肽类抗生素的主要微生物菌种之一，能够分泌合成几十种脂肽类抗生素，主要分属于表面活性素、杆菌霉素、泛革素和罗克霉素。一株优良的枯草芽胞杆菌通常能分泌其中2～3家簇脂肽类抗生素。枯草芽胞杆菌Bs916能够同时分泌合成四大家簇脂肽类抗生素，是一株理想的研究脂肽类抗生素活性的微生物菌株。

本论文设计构建了枯草芽胞杆菌Bs916不同脂肽类抗生素缺失突变株，并建立了采用酸沉淀、甲醇抽提和柱层析的方法得到4种脂肽类抗生素表面活性素、杆菌霉素L、泛革素和罗克霉素纯品;并对制备的纯化物的生物活性进行了初步分析。结果表明制备的4种脂肽类抗生素都达到了色谱纯和电泳纯，这为以后深入研究这4种脂肽类抗生素奠定基础，也为采用生物技术的方法制备其他种类脂肽抗生素提供了借鉴。本论文还对4种脂肽类抗生素的抗细菌活性、抗真菌活性和溶血活性进行了初步研究，发现脂肽类抗生素的结构多样行决定了其生物学功能多样性。表面活性素虽然由于其具有强溶血活性，降低了它开发为医药制剂可能，但在化妆品领域以及作为服装抗皱剂方面具有广泛应用。杆菌霉素L和泛革素具有强抗真菌活性，目前正在开发作为抗真菌剂。罗克霉素由于强的抗细菌活性和低溶血活性，具有开发为抗细菌制剂的潜力。