冻藏过程中南极磷虾蛋白理化特性和品质的变化

,

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

南极磷虾(Euphausiasuperba)又名南极大磷虾,属甲壳动物纲,最新生物储存量约为3.79亿吨[1-2]。作为地球上最大的单种生物资源之一,南极磷虾是南极海洋生态系统中高级捕食者的重要食物来源[3-4]。除具有巨大的生物量,南极磷虾还具有蛋白质含量高、营养价值高的特点,因此作为潜在的渔业资源逐渐受到人们关注[3-6]。

南极磷虾肌肉蛋白含量高达60%～65%(干重)[7],蛋白生物值高于肉蛋白及牛奶蛋白,仅次于鸡蛋蛋白[8];同时,南极磷虾脂质是一种新型的海洋功能性油脂,含量为4.45%～0.25%(湿重)[9],其营养性相对较高。在我国人口众多、自然资源相对匮乏的大国背景下,南极生物资源综合开发利用具有着重要的战略意义[6]。

然而，目前南极磷虾蛋白资源利用度有限,根据已有文献,南极磷虾体内含有大量自溶酶,死后酶活控制系统急剧减弱,肌肉自溶会导致虾肉功能特性和品质下降[8,10];同时,肌肉在冷冻储藏过程中,蛋白会发生变性,蛋白功能性质随之降低[11];此外,虾体水分升华、蛋白分解、脂肪发生氧化等也会导致虾体品质下降[11-13]。

国内外已有文献主要分析了南极磷虾冻藏过程盐溶性蛋白含量与成糜性质的变化[11,13-14]。这些研究对冷冻贮藏的该蛋白功能性分析缺少全面性,冷冻贮藏过程中水溶性蛋白、碱溶性蛋白和不溶性蛋白的变化分析较少。且已有文献贮藏时间较短[3,11],缺乏全面性。因此,本实验在60～200 d范围内,研究了南极磷虾全虾(不去头、不去皮)、虾肉(去头、去皮)在冻藏过程中的蛋白组成(尤其是碱溶性蛋白、不溶性蛋白含量)变化并对各指标进行了相关性分析,以期为开发新的南极磷虾蛋白产品提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻南极磷虾全虾(不去头、不去皮)和虾肉(去头、去皮) 辽宁大连渔业有限公司,于2017年3月捕捞,2017年5月运送到实验室冻藏于-20 ℃冰箱待使用；3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-丙磺酸(CHAPS)、低熔点琼脂糖 美国Bio-Rad公司;二硫苏糖醇(DTT)、过硫酸铵(AP)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED) 美国 Amersham公司;碘乙酰胺(IAA) 瑞典Amersham公司;覆盖油(Cover Oil) 美国GE公司;磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·7H2O)、氯化钠(NaCl)、三氯乙酸(TCA)、2-硫代巴比妥酸(TBA)、氯仿 上海国药集团;所用试剂均为分析纯。

TGL16型高速冷冻离心机 长沙英泰仪器有限公司;Kjeltec 8400型全自动凯氏定氮仪 瑞典FOSS公司;ETTAN IPGphor 3型等电聚焦电泳仪 美国GE公司;ESH105型水分测定仪 上海舜宇恒平有限公司;PHS-3C型酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司;UV-2550型紫外分光光度计 苏州岛津仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南极磷虾贮藏条件 南极磷虾捕捞后运输期间和后期实验期间贮藏均为-20 ℃冻藏。运输时间包括在内,因而冻藏时间从60 d算起,分别为60、80、100、120、140、160、200 d。样品有脱壳虾肉和未脱壳的全虾两种,在贮藏时间节点取样,取样量为10 g。将所取样品直接在未解冻状态下打碎,至于4 ℃下备用,经预处理的样品在12 h内用完。每次随机取待测样3份进行测量。

1.2.2 各蛋白组分的分离提取与测定 不同蛋白组分提取根据Kolakowski[15]的方法稍作改变,取10 g混合均匀的待测样品,与冷藏蒸馏水(1∶10) g/mL混合,匀浆,置于4 ℃抽提10 min,8500 r/min离心10 min,分离总水溶性蛋白和剩余蛋白;在总水溶性蛋白中加入10%的三氯乙酸(1∶1),静置分离,分别得非蛋白氮(NPN)(溶液)和水溶性蛋白(沉淀);在剩余蛋白中加入1.1 mol/L NaCl-0.1 mol/L的磷酸缓冲液,置于4 ℃抽提10 min,8500 r/min离心15 min,分离得盐溶性蛋白(溶液)和沉淀;在沉淀中加入0.1 mol/L NaOH,置于4 ℃抽提10 min,8500 r/min离心15 min,分离得碱溶性蛋白(溶液)和不溶性蛋白(沉淀)。蛋白含量测定采用凯氏定氮法(GB 5009.5-2010)。

1.2.4 水分含量 用水分测定仪测定,温度参数设定为105 ℃。取约1.5 g的匀浆样品分别放置在水分测定仪托盘中,每组样品测量三次,取平行。结果用%表示。

1.2.5 持水率 根据Robertson等[17]法稍做改动,取质量(M)为30 g匀浆的待测样品于离心管,4 ℃条件下9000 r/min离心15 min,倒去上层汁液,称量残余虾肉质量(m),以损失汁液占待测样品鲜质量的质量分数计算为汁液持水率(W),即

1.2.6 pH 根据Fan等[18]法稍作改动,称取(10±0.01) g匀浆的待测样品,以1∶10加去离子水,匀浆机混匀,4 ℃浸提10 min,8500 r/min离心10 min,取上清液,用pH计测定。

1.2.7 硫代巴比妥酸反应物(TBARS) 根据Zhang等[19]的方法，称取25 g混匀样品于锥形瓶中,加入50 mL 7.5%的TCA溶液,振荡提取30 min,于6500 r/min离心10 min。准确移取5 mL上清液于离心管中并加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液,90 ℃水浴40 min,取出于冷水中快速冷却,加入5 mL氯仿后,振荡摇匀后静置分层,以1600 r/min离心5 min,上清液分别在532、600、450 nm处测吸光值,以5 mL三氯乙酸溶液加5 mL TBA作为样品空白对照。

TBA(mol/L)=6.45×A532-A600-0.56×A450

TBARS(mg MDA/kg)=(TBA(mol/L)×10-3×144.15×10)[m×(1-w)]

两台相机的对焦系统都是各自品牌的顶级配置。X-H1的混合对焦系统能够应付大部分场景，只有在非常极端的情况下才会输给尼康D500，我们认为一部分原因是相位对焦系统原理更直接，技术上也更成熟，另一部分因为无延时的光学取景器让用户可以更容易地将对焦点对准运动物体。

式中,TBARS(mg MDA/Kg):硫酸巴比妥酸反应物(干重);m:样品的质量(g);w:对应样品的水分含量(%),A:不同波长下的吸光值。

1.3 数据处理

数据计算用平均值和标准差(SD),最小显著性差异(LSD)(p<0.05),使用平均值之间的比较差异。数据用Origin 8.5,SPSS 17.0软件进行分析,三次平行实验。

2 结果与分析

2.1 各组分蛋白含量的变化

冻藏初期(60 d)南极磷虾全虾和虾肉水溶性蛋白分别占总蛋白的23.87%和15.26%,盐溶性蛋白占19.24%和37.3%,碱溶性蛋白占19.44%和17.91%,不溶性蛋白占4.89%和2.95%。

图1显示,全虾的水溶性蛋白、碱溶性蛋白和不溶性蛋白均高于虾肉,盐溶性蛋白含量显著低于虾肉(p<0.05)。随冻藏时间的增加,全虾和虾肉中水溶性蛋白含量略有减少,盐溶性蛋白含量下降,碱溶性蛋白含量上升,不溶性蛋白含量变化不大。至冻藏200 d,全虾和虾肉的盐溶性蛋白分别由19.24%和37.3%降至11.9%和28.5%;碱溶性蛋白则由19.44%和17.91%增至32.91%和27.79%,这两种变化均具有显著性差异(p<0.05)。从实验开始到实验结束,水溶和不溶性蛋白成分的变化均未有显著性差异(p>0.05)。有文献认为，这种盐溶性蛋白含量的减少与磷虾体内的自溶酶存在有关[20-21];而碱溶性蛋白含量增加则与冻藏过程中蛋白分子间氢键、疏水键、二硫键和盐键等的形成有关[22-26]。依据以上文献逻辑,盐溶性蛋白的降低可能会带来水溶性蛋白含量的增加,然而本文试验中并未发现这种相应的变化。因为在自溶酶和微生物的作用下,随冻藏时间增加蛋白会降解为胺类物质[11],因而部分水溶性蛋白可能发生降解。

图1 冻藏过程中南极磷虾全虾(a)和虾肉(b)不同组分蛋白含量变化Fig.1 Changes in protein contents of different protein components of whole krill(a) and krill meat(b)during frozen storage

盐溶性蛋白是鱼虾成糜性的重要蛋白,其含量影响糜制品的凝胶性能[27],因此,长期冻藏的南极磷虾不会是理想的成糜性原料,这一推测与已有报道相吻合[28]。由此来看,应另选技术或产品形式来对南极磷虾中的优质蛋白加以利用。

2.2 非蛋白氮(NPN)的变化

冻藏初期(60 d时),全虾和虾肉的NPN含量分别为20.72%和14.83%。图2显示,随着冻藏时间增加,南极磷虾全虾和虾肉的NPN含量不断增加。冻藏200 d后,全虾和虾肉的NPN含量分别增至27.36%和24.87%,与冻藏初期有显著性差异(p<0.05)。

图2 冻藏对南极磷虾全虾和虾肉NPN含量的影响Fig.2 Effects of frozen storage on NPN contents of Antarctic krill whole krill and krill meat

NPN是蛋白氮以外的多肽氮、游离氨基酸、胺类及胺氧化物、核酸肽氮及挥发性盐基氮等的总和[29]。相关文献认为,长时间冻藏中NPN值的增加主要与嗜寒性腐败微生物(如乳酸菌等)有关[11,30]。因此,水溶性蛋白含量(图1)相对稳定的主要原因在于:肌肉蛋白在自溶酶作用下发生自溶[20-21],因而盐溶性蛋白可能被降解为水溶性蛋白;而腐败微生物作用于蛋白产生胺类物质[11],故部分水溶性蛋白可能被降解成NPN。

2.3 不同组分蛋白的双向电泳图

图3显示,冻藏初期(60 d)南极磷虾的水溶性蛋白、盐溶性蛋白、碱溶性蛋白的蛋白点数均多于冻藏终期(200 d)的蛋白点数。从等电点来看,水溶性蛋白(图3a1～a2)和碱溶性蛋白(图3c1～c2)的蛋白点主要分布在pH4～6和pH8～9;盐溶性蛋白(图3b1～b2)的蛋白点均大多集中在酸性端(pH4～6)。

图3 南极磷虾水溶性蛋白(a1&a2),盐溶性蛋白(b1&b2)和碱溶性蛋白(c1&c2)双向电泳图Fig.3 2-DE spectrum of Antarctic krill water-soluble protein(a1&a2),salt-soluble protein(b1&b2)and alkali-soluble protein(c1&c2)注:a1、b1、c1:冻藏初期(60 d);a2、b2、c2:冻藏终期(200 d)。

从分子量来看,冻藏初期和终期水溶性蛋白点(图3a1～a2)变化不大,大多数分布在分子量为25～55 kDa,少数分布在分子量<15 kDa;冻藏终期25～55 kDa区域的蛋白点有少量丢失。冻藏初期盐溶性蛋白点(图3b1)主要分布在25～130 kDa和<15 kDa;冻藏终期(图3b2)蛋白点则更趋集中于25～55 kDa,而>55 kDa和<15 kDa的蛋白点相对含量明显减少。

盐溶性蛋白主要成分是肌原纤维蛋白,该蛋白主要包括480 kDa的大分子肌球蛋白、肌动蛋白(43 kDa)和原肌球蛋白(38 kDa)。每个肌球蛋白分子由两条210 kDa的重链和四条17～23 kDa的轻链组成[27]。由图3可知,从冻藏初期到终期,肌动蛋白、原肌球蛋白损失较少;而肌球蛋白的重链和轻链均出现严重损失。该结果可能与自溶酶的降解相关。而盐溶性蛋白结构破坏也影响蛋白的凝胶性[27]。

冻藏初期到终期,碱溶性蛋白点(图3c1～c2)在整个分子量区域均有分布,这与文献所报道的冻藏过程中碱溶性蛋白增加机理相吻合[22-26],自溶酶对碱溶性蛋白点的相对成分分布影响不大。结合前文(图1),碱溶性蛋白含量的增加可能和冷冻变性相关。

2.4 含水量和持水率的变化

图4表明，随冻藏时间的增加,南极磷虾的含水量和持水率均呈下降趋势。全虾和虾肉水分含量冻藏初期为79.06%和84.31%,终期分别下降至74.21%和81.47%。经统计分析,冻藏终期两组含水量均有显著性下降(p<0.05)。这可能由于冻藏过程中存在升华现象所致[12]。

图4b显示，全虾和虾肉持水率从冻藏初期的71.52%和69.17%分别下降至终期的59.46%和65.69%,统计分析表明,其降幅显著(p<0.05)。持水率表示肌肉蛋白对水的保持能力,持水率越高,说明肌肉蛋白成糜性越好[31]。这种水分保持能力的丧失与肌原纤维蛋白的三维结构冷冻变性相关[32],这与碱溶性蛋白大量增加的原因相一致。

图4 冻藏对南极磷虾全虾和虾肉含水量和持水率的影响Fig.4 Effects of frozen storage on moisture contents and holding water contents of Antarctic krill whole krill and krill meat

2.5 pH的变化

pH是反应虾品质变化的指标之一。图5显示,在冻藏过程中南极磷虾全虾和虾肉的pH均呈上升趋势。统计分析表明,全虾中的pH上升具有显著性差异(p<0.05),而虾肉的pH仅从6.95增至7.12。在自溶酶和微生物作用下,蛋白分解成胺类及氨等碱性物质[11],因而pH逐渐增加。冻藏期间,全虾的pH明显高于虾肉,这是因为南极磷虾的消化腺酶主要存在于虾头胸部,因而相较于去皮去头的虾肉,全虾含有较多的自溶酶[20]。

图5 冻藏对南极磷虾全虾和虾肉pH的影响Fig.5 Effects of frozen storage on pH of Antarctic krill whole krill and krill meat

2.6 TBARS值的变化

TBARS值可作为虾肌肉中脂肪氧化程度的虾品质指标[3,9]。南极磷虾中不饱和脂肪酸含量高,易发生氧化,因而TBARS值变化可反映南极磷虾在冻藏过程中的品质变化[3]。图6显示,冻藏过程中南极磷虾全虾的TBARS值从初期的1.94 mg MDA/kg先极速增加,100 d后增加趋势放缓,至终期增加为10.4 mg MDA/kg。统计分析显示,全虾的TBARS值增加显著(p<0.05)。虾肉的TBARS值也有缓慢的增加趋势,从初期0.5 mg MDA/kg增加至3.56 mg MDA/kg,但差异并不显著(p>0.05)。说明随着冻藏时间的增加,南极磷虾的氧化程度增加,品质下降。

图6 冻藏对南极磷虾全虾和虾肉TBARS值的影响Fig.6 Effects of frozen storage on TBARS value of Antarctic krill whole krill and krill meat

2.7 各指标间相关性分析

对全虾和虾肉各指标进行相关性分析,结果如表1所示,冻藏过程中全虾含水量与持水率呈显著正相关(p<0.05);pH与含水量、持水率呈极显著负相关(p<0.01);持水率与TBARS值呈显著负相关(p<0.05);pH与TBARS值呈极显著正相关(p<0.01)。冻藏过程中虾肉含水量与TBARS值呈极显著负相关(p<0.01)。这说明,含水量、持水率、pH和TBARS值的变化在反映南极磷虾品质随冻藏时间的变化方面具有一定的一致性。

表1 全虾和虾肉各指标间相关性分析Table 1 Correlation analysis among various indexes of Antarctic krill whole krill and krill meat

3 结论

从冻藏初期到终期,南极磷虾全虾和虾肉盐溶性蛋白下降显著(p<0.05),碱溶性蛋白和NPN显著上升(p<0.05),说明各组分蛋白含量随冻藏时间增加发生变化,进而影响蛋白的凝胶性。二维电泳结果说明了盐溶性蛋白的损失主要发生在肌球蛋白重链(210 kDa)和轻链(17～23 kDa)分子上,进一步表明60～200 d的长时间冻藏可降低南极磷虾蛋白的凝胶性,碱溶性蛋白中蛋白点的分布基本不变,其含量的增加则可能主要和冷冻变性相关。从冻藏60 d起,至冻藏200 d止,全虾和虾肉的含水量和持水率均显著下降(p<0.05),而pH和TBARS值仅在全虾中出现显著升高现象(p<0.05),表明全虾和虾肉品质均会劣化,虾肉较全虾的劣化程度为轻。各指标相关性分析表明，冻藏过程中南极磷虾各品质指标的变化趋势具有一定的一致性。

综上,南极磷虾蛋白的最大特点在于,碱溶性蛋白含量较高,且在冻藏过程中大量增加;而盐溶性蛋白降解显著。因而,未来考虑其蛋白成分的应用和产品化技术开发时,应尽量避免进行成糜性能研究。