液相色谱串联质谱法同时检测蔬菜中28种农药残留

杨玉平，涂林，金婵，覃娟，李文博，唐婧苗，谢柏艳

（武汉药品医疗器械检验所，湖北武汉430075）

农药广泛应用于农业生产，它在防治病虫害等方面发挥着显著的作用，但在实际操作过程中，由于农药产品的质量和管理力度问题，导致不科学、不合理使用农药的情况时有发生[1]，随着社会经济的发展和人们生活水平的不断提高，人们越来越重视食用农产品的安全卫生，因此蔬菜样品中农药残留问题也越来越引起人们的关注。农药残留的监督和检测体系是加强农药管理的重要环节，因此建立一个准确、快速、方便可行的检测方法尤为重要[2]。

农药多残留分析方法一般采用气相色谱法（gas chromatography，GC）[3]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[4-5]、气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）[6]、液相色谱-质谱联用法（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）[7-8]等。但是由于需要检测的农药种类和组分繁多，以及样品中多残留共存的现象突出，使得单一的检测方法很难满足所有多残留样品的检测要求，有效应用联用技术和仪器，是解决以上问题的根本方法[9]。而且，欧盟委员会2002/657/EC决议中规定[10]：对于禁用农药的阳性结果必须经过质谱确认，以保证定性、定量检测的可靠性，降低假阳性率。LC-MS/MS能够区分或消除复杂基质中的其他物质的干扰，灵敏度高，分析速度快，所以被认为是分析复杂基质中农药残留最准确可靠的技术[11-13]。

本文旨在研究建立一种高效、适用性强的HPLC/MS/MS检测方法，同时检测蔬菜中不同种类、性质差异较大的28种农药，研究方法的加标回收率、精密度、检出限、线性范围、基质适用性等。结合参考文献[14-17]及国家食药监总局定期公布的食用农产品监督抽查结果分析，有针对性的选取了克百威、氧化乐果、多菌灵、啶虫脒等28种毒性较强、检出率较高的农药并且用建立的分析方法对来自不同集贸市场的500批蔬菜样品进行了定量定性分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蔬菜样品来自各个集贸市场，蔬菜品种涉及青椒、白菜、西红柿、黄瓜、花椰菜、芹菜、豆角、葱、蒜、韭菜、土豆等常见品种。

甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷均为液相色谱级：Fisher chemical；甲酸、乙酸铵均为分析纯：国药集团；氯化钠（分析纯）：国药集团，用前在140℃烘烤4 h；无水硫酸钠（分析纯）：国药集团，用前在650℃灼烧1 h，贮于干燥器中，冷却后备用；NH2固相萃取柱（500 mg/6 mL）：天津博纳艾杰尔公司；异丙威、甲萘威、抗蚜威、多菌灵、残杀威、甲拌磷、毒死蜱、甲胺磷、嘧霉胺、仲丁威、克百威、乐果、灭线磷、乙拌磷、倍硫磷、乙硫磷、马拉硫磷、丙溴磷、敌敌畏、涕灭威砜、速灭威、杀螟硫磷、腐霉利、亚胺硫磷、氧乐果、啶虫脒：农业部环境保护科研监测所，质量浓度为100 μg/mL；阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐：农业部环境质量监督检验测试中心，阿维菌素质量浓度为100 μg/mL，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐为固体对照。

1.2 仪器与设备

API4000高效液相色谱-串联质谱仪：美国ABSciex公司；T25高速组织匀浆仪：德国IKA；HY-5调速多用振荡器：常州国华电器有限公司；L530离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；ASE-12固相萃取仪：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；N-EVAP112氮吹仪：美国OA。

1.3 方法

1.3.1 样品提取与净化

蔬菜样品取可食部分切碎、混匀。称取混匀的样品20 g（精确至0.01 g）于具塞锥形瓶中，加40 mL乙腈，用高速组织匀浆机在15 000 r/min匀浆提取1 min，加入约5 g氯化钠，再匀浆提取1 min，再3 000 r/min离心5 min，吸取上层溶液过无水硫酸钠后，精密量取10 mL于45℃水浴减压浓缩近干；用1 mL淋洗液（丙酮∶二氯甲烷=1∶1）洗涤平底烧瓶3次，并分别把洗涤液转移到活化好的NH2柱上，当液面到达固相萃取（solid phase extraction，SPE）柱筛板表面后，再加入淋洗液22 mL，收集全部淋洗液，于45℃水浴减压浓缩近干，氮气吹干，用10 mL甲醇准确定容,用0.22 μm滤膜滤过，上清液供液相色谱-串联质谱测定。

1.3.2 标准溶液的配制

28种农药标准溶液用甲醇配制成10 μg/mL的单标储备液，置于-18℃冰箱中保存。使用时用甲醇稀释成适当浓度的混合标准工作溶液。

基质匹配标准溶液：用空白样品基质提取液将混合标准溶液配制啶虫脒为 7.5、15、30、45、60、75、150、225、300 ng/mL，其他农药为 5、10、20、30、40、60、100、15、200 ng/mL系列基质匹配标准工作液，基质匹配标准溶液需现用现配。

1.3.3 色谱与质谱条件

1.3.3.1 液相色谱条件

色谱柱：Agilent C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流速：0.2 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；流动相：A为0.005 mol/L乙酸铵+0.05%甲酸水溶液；B为乙腈；梯度洗脱程序见表1。

表1 28种农药的梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedures for 28 pesticides

1.3.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI+）；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测；喷雾电压：5 500 V；去溶剂温度：500 ℃；气帘气：275.8 kPa；雾化气：344.75 kPa；辅助加热气：344.75 kPa；定性离子对、定量离子对、去簇电压及碰撞气能量见表2。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的优化

蔬菜样品基质差异较大，而且色素含量较多，选取合适的提取溶剂，有利于后续净化过程的操作。本试验对比了乙酸乙酯、丙酮、乙腈3种提取溶剂，以乙酸乙酯提取，部分农药回收率较低；以丙酮和乙腈提取时均能得到较好的回收率，但丙酮提取液水分较多，溶液颜色较深，对后续净化过程的要求较高。而乙腈对大多数农药有较好的溶解性，提取液在加入NaCl充分振摇后离心可以与水相充分分离，而且对环境污染和人体危害较小，因此选取乙腈作为提取溶剂。

表2 28种农药的保留时间和质谱分析参数Table 2 Retention times and mass spectrometric analysis parameters for 28 pesticides

2.2 净化条件的优化

SPE是一种经典的净化方式，具有节省溶剂、经济、高效等特点，因此本文选取SPE作为净化方法。固相萃取柱常用的填料有石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、NH2和 C18等。GCB 对色素有强烈的吸附效果，NH2具有极性固定相和弱阴离子交换剂，可通过弱阴离子交换或极性吸附达到保留作用，因此具有双重作用，C18多用于去除脂肪等非极性杂质[18]。研究表明，GCB在吸附色素的同时，会导致含有平面结构的农药如多菌灵、氟虫腈等回收率急剧降低[19-20]，因此，参考国家标准GB/T 20769-2008《水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》中前处理方法采用NH2净化柱[21]，含有平面结构的农药回收率满足国家标准要求，因此本试验选取NH2固相萃取柱做为净化柱。

2.3 色谱条件优化

液相流动相的组成不仅会影响到目标化合物的保留时间和峰形，还会影响到离子化效率，从而影响检测灵敏度。本方法比较了乙腈-水（V+V）、乙腈-0.1%甲酸水溶液（V+V）、乙腈-0.005 mol/L乙酸铵+0.05%甲酸水溶液（V+V）3种流动相，结果表明在酸性条件下不仅可以提高目标物的离子化程度，还可以改善峰形，因此选取加入甲酸的流动相。进一步比较乙腈-0.1%甲酸水溶液（V+V）、乙腈-0.005 mol/L乙酸铵+0.05%甲酸水溶液（V+V）这两种流动相，结果表明后者为流动相时，各目标物峰型较好，响应较高，综合考虑后决定选取乙腈-0.005 mol/L乙酸铵+0.05%甲酸水溶液（V+V）为流动相。通过不断摸索色谱柱梯度洗脱程序，使得28种农药在30分钟内得到很好的分离。图1为空白基质样品中添加20 μg/kg农药的提取离子色谱图。

图1 空白样品基质中添加20 μg/kg农药的提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms of a blank spiked with28 pesticides at 20 μg/kg

2.4 质谱条件优化

首先在电喷雾离子源正离子模式下，先对28种农药的单标溶液进行全扫描，获得稳定的母离子，选取[M+H]母离子进行二级碰撞，每个化合物至少选取两对离子进行测定，一对离子作为定量离子，一对离子作为定性离子[19]。本研究对28种目标农药的分析条件进行了优化，包括选取合适的特征离子对和优化去簇电压和碰撞能量等参数，最终确立了1.3.3.2的质谱条件。

2.5 方法学验证

2.5.1 方法的线性范围和检出限、定量限

由于食品样本基质背景复杂，在前处理净化后并不能完全去除杂质的干扰，样品共流出物的存在对目标化合物的离子化效率产生很大的影响，基质效应成为影响分析结果的准确度与精密度的关键因素[22]，消除和补偿分析中带来的基质效应，常采用基质匹配标准溶液[23-25]。本研究采用空白基质匹配标准溶液外标法进行校准定量。

配制好的基质匹配标准溶液，按照优化好的色谱和质谱条件进行测定，以目标物的质量浓度X（ng/mL）为横坐标，以定量离子对的峰面积Y为纵坐标，绘制基质标准曲线。分别以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10），确定方法的检出限和定量限。28种农药的回归方程、线性范围、相关系数和定量限见表3。

表3 28种农药的线性范围、回归方程、定量限、加标回收率和相对标准偏差Table 3 The linear ranges，regression equations，limits of quantitation，recoveries and relative stardard deviations of 28 pesticides

由表3可见，本方法检出限低、灵敏度高、相关性好，适用于28种农药的定量分析。

2.5.2 方法的回收率和精密度

本方法采用阴性蔬菜样品的加标试验来进行准确度和精密度评价，啶虫脒在 30、60、150 μg/kg 3 个添加水平，其他农药在 20、40、100 μg/kg 3 个添加水平，每个水平重复6次，测得平均回收率为63.9%～120.4%，相对标准偏差为2.4%～9.8%，结果见表3。从表3可以看出，本方法的准确度和精密度均能满足目标化合物的实验室监测要求。

2.5.3 实际样品的检测

采用本文建立的方法对来自各个不同集贸市场的约50批样品进行检测，品种涉及青椒、白菜、西红柿、黄瓜、花椰菜、芹菜、豆角，大葱、大蒜、土豆等常见品种。对50批样品分析结果发现，多菌灵、啶虫脒的检出率较高，检出率约5%，根据GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定，多菌灵、啶虫脒的检出量均在农药最大残留量的允许范围内，符合国家标准规定，其他农药的检出率较低。对检测出的农药根据欧盟委员会2002/657/EC决议进行了定性确证，结果表明本方法适合同时分析不同蔬菜品种中28种农药残留，基质干扰较小，能够满足实验室日常检测任务需要。

3 结论

通过对方法的提取溶剂、净化条件、色谱、质谱等条件的优化，建立了一种采用乙腈提取，SPE净化，同时检测不同蔬菜品种中28种农药残留的高效液相色谱-串联质谱方法，该方法具有应用范围广、灵敏度高等特点，实现了28种农药残留的同时快速检测，检出限、定量限均符合国家标准，重现性好、稳定性优，基质适用性好，可应用于实验室的日常检测工作。