大孔树脂纯化紫薯结合酚的研究

谭畅 曹靖滢 冯颖 杜姗姗

摘要：采用大孔树脂对紫薯结合酚粗提液进行纯化，研究各因素对纯化效果的影响，并确定纯化工艺参数。结果表明：HPD-100大孔树脂适于纯化紫薯结合酚，当上样液浓度为0.25 mg/mL、上样液pH值为3.0、上样体积为3.6 BV时，HPD-100大孔树脂对紫薯结合酚的吸附率可达78.08%±0.04%；以pH值5.0、体积分数50%的乙醇水溶液为解吸剂，解吸体积为6.8 BV，解吸率可达81.45%±0.34%。

关键词：紫薯；结合酚；大孔树脂；纯化；吸附；解吸

中图分类号：TS215 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2018）04-0039-04

植物多酚为植物体内复杂的酚类次生代谢产物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、防治心血管疾病等广泛的药理活性。随着人们健康意识的增强，植物多酚逐渐成为食品科学领域的研究热点。根据存在形式，植物多酚可分为游离态和结合态两种，游离酚是游离于细胞质中的多酚，具有良好的溶解性，易溶于水或有机溶剂；而结合酚与细胞壁中纤维素、果胶、蛋白等结合，不能直接用溶剂萃取得到，需经过酶解或强酸强碱溶液释放后才能得到，因此常被忽略。然而这些结合酚却是食物中具有生物活性的有益成分，朱春秋等人的研究表明结合酚可被大鼠通过消化道吸收，且具有良好的体内抗氧化能力；Jung等人发现结合酚可以在结肠中释放并产生一定的生物活性，有益于人体健康。相对于游离酚，结合酚经肠道微生物菌群发酵作用后能发挥更强的生物活性。由于结合酚具有这些良好的生物活性，近年来人们开始关注结合酚，目前在应用酸水解法、碱水解法释放结合酚的工艺参数优化方面进行了较多的研究。对释放出来的结合酚，通常采用乙酸乙酯萃取的方法进行纯化，该方法消耗大量有机溶剂、成本高、结合酚得率低。大孔吸附树脂可以通过良好的大孔网状结构和较大的比表面积，有选择性地物理吸附水溶液中的有机物，有效去除淀粉、还原糖、蛋白质等杂质，工艺简单、操作方便、成本低廉，广泛应用于游离酚的纯化，如Lisha Xi等人采用AB-8大孔树脂纯化了甘薯叶游离多酚；但在应用大孔树脂纯化结合酚方面的研究缺乏。本课题将大孔树脂应用于紫薯结合酚的纯化，以期为紫薯结合酚的制备及进一步活性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验用甘薯：品种“辽薯20”，由辽宁省农科院提供。

大孔树脂HPD-100，HPD-400，HPD-600，HPD-700，D101，AB-8，ADS-7，S-8，D-4020，NKA-9：沧州宝恩化工有限公司；无水乙醇、碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠、三氯化铁、铁氰化钾、盐酸、氯化钾、醋酸、醋酸钠、福林酚试剂：均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

电子天平：上海舜宇恒科学仪器有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器责任有限公司；DK-S26型电热恒温水浴锅；DHG-9070A型恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；pH计：上海荣汉自动化仪表有限公司；旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HL-2型数显恒流泵：上海沪西分析仪器厂有限公司；HZQ-F型全温振荡培养箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；CR21G型冷冻离心机：日立有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 紫薯结合酚粗提液（上样液）的制备 取50 g紫薯冻干粉，以料液比1∶10的比例加入体积分数60%的乙醇水溶液，于50 ℃水浴中放置2 h提取游离酚，

10 000 r/min离心20 min，弃去上清液，保留滤渣；按上述步骤重复提取2次，至游离酚提取完全，将滤渣真空干燥至质量恒定。取充分提取游离酚后的干燥滤渣，以料液比1∶10加入2 mol/L的NaOH溶液，于室温下用磁力搅拌器水解5 h以释放结合酚，水解结束后以10 000 r/min离心20 min，弃去滤渣，收集上清液即为结合酚粗提液。

1.3.2 大孔树脂的预处理 将大孔树脂以无水乙醇浸泡24 h后，用蒸馏水沖洗至树脂无乙醇气味为止，然后浸泡在蒸馏水中备用，以防树脂干燥结块。

1.3.3 大孔树脂的静态吸附解吸 1） 静态吸附。称取经过预处理的大孔树脂1.0 g置于锥形瓶中，分别加入浓度为0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL和pH值为1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0的紫薯结合酚粗提液40 mL，密封后于室温下在振荡培养箱中振荡吸附12 h（100 r/min），抽滤，测定滤液中结合酚浓度，计算吸附率，依次考察上样液浓度和pH值对树脂吸附效果的影响。2） 静态解吸。将过滤后的树脂置于锥形瓶中，分别加入体积分数为10%，30%，50%，70%，90%和pH值为1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0的乙醇水溶液40 mL，密封后于室温下在振荡培养箱中振荡解吸12 h（100 r/min），抽滤，测定滤液中结合酚浓度，计算解吸率，依次考察乙醇体积分数和pH值对树脂解吸效果的影响。

1.3.4 大孔树脂的动态吸附解吸 1） 动态吸附。称取树脂20 g，装柱（Φ1.5 cm×40.0 cm），用pH值3.0、浓度0.25 mg/mL的结合酚上样液上样，进行吸附，每10.0 mL收集一次流出液，测定其吸光度，计算吸附率，考察上样体积对树脂吸附效果的影响。2） 动态解吸。以pH值5.0、流速1.0 mL/min、体积分数50%的乙醇水溶液解吸，每10.0 mL收集一次流出液，测定其吸光度，计算解吸率，考察解吸剂体积对树脂解吸效果的影响。

1.3.5 树脂吸附率和解吸率的计算

1） 吸附率的计算公式为：

A=×100%

式中：A为吸附率，%；C0为起始浓度，mg/mL；C1为平衡浓度，mg/mL。

2） 解吸率的计算公式为：

D=×100%

式中：D为解吸率，%；C2为解吸后溶液中总酚浓度，mg/mL；V1为吸附溶液体积，mL；V2为解吸溶液体积，mL。

1.3.6 结合酚含量的测定 1） 标准曲线绘制。参考Mary的方法，精确称取没食子酸0.1 g，用蒸馏水配制成浓度为1.0 mg/mL的溶液，分别吸取该溶液0，0.3，0.5，1.0，1.2，1.5 mL于10.0 mL刻度试管中，用蒸馏水定容，摇匀。然后从各浓度溶液中吸取0.5 mL加入到10.0 mL离心管中，分别用蒸馏水定容到5.0 mL，再加入0.5 mL福林酚试剂，摇匀，加入0.5 mol/L的碳酸钠溶液1.0 mL，摇匀。放置1 h，以空白来调零，于725 nm下测定吸光度，平行测定3次。标准曲线回归方程：y=4.927 0 x-0.021 2，R2=0.999 2。式中：y为待测样品在725 nm处的吸光度；x为待测样中多酚的质量浓度，mg/mL。2） 样品测定。取样液0.5 mL，参照上述标准曲线制作方法进行测定，通过标准曲线计算其结合酚的浓度。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的筛选

选取10种大孔树脂AB-8，HPD-100，HPD-400，HPD-600，HPD-700，D101，ADS-7，S-8，D4020，NKA-9，

进行静态吸附和解吸，选取对紫薯结合酚吸附和解吸效果好的大孔树脂进一步优化工艺参数。试验结果见表1。

由表1可知：大孔树脂S-8对紫薯结合酚的吸附率最高；ADS-7，HPD-100，D101，HPD-400次之，四者之间无显著性差异。NKA-9，D-4020对紫薯结合酚的解吸率最高；HPD-100，HPD-700，HPD-400，AB-8次之，四者之间无显著性差异。综合吸附率和解吸率，选择HPD-100对紫薯结合酚进行纯化。

2.2 上样液浓度对树脂吸附结合酚效果的影响

不同上样液浓度下树脂吸附结合酚的效果如图1所示。

由图1可以看出：随着上样液中结合酚浓度增大，树脂对结合酚的吸附率呈显著的升高趋势。考虑到结合酚浓缩需要消耗较多热能，且加热过程中会造成结合酚的损失，选择0.25 mg/mL作为结合酚最佳的上样液浓度。

2.3 上样液pH值对树脂吸附结合酚效果的影响

不同上样液pH值下树脂吸附结合酚的效果如图2所示。

由图2可以看出：树脂对紫薯结合酚的吸附率在酸性环境条件下明显高于中性和碱性环境，这可能是因为酚类物质在酸性条件下更为稳定。在pH值为1.0和3.0条件下，树脂对紫薯结合酚的吸附率无显著性差异，从节省调整pH值所消耗试剂的角度考虑，选择上样液的pH值为3.0。

2.4 上样体积对树脂吸附结合酚效果的影响

不同上样体积下树脂吸附结合酚的效果如图3所示。

由图3可以看出：随着上样体积增加，树脂对结合酚的吸附率逐渐降低，当上样体积为90 mL时，吸附率已经降低到75%以下。选择上样体积为80 mL，即3.6 BV。

2.5 乙醇体积分数对树脂解吸结合酚效果的影响

不同乙醇体积分数下树脂解吸结合酚的效果如图4所示。

由图4可以看出：随着乙醇体积分数增加，树脂对结合酚的解吸率逐渐升高，当乙醇体积分数为50%时达到最大；乙醇体积分数继续增加，溶剂极性减小，导致对结合酚的解吸效果下降。因此，选择结合酚的解吸剂浓度为50%。

2.6 解吸剂pH值对树脂解吸结合酚效果的影响

不同解吸剂pH值下树脂解吸结合酚的效果如图5所示。

由图5可以看出：中性条件下树脂对结合酚的解吸率最低；在酸性条件和碱性条件下，pH值越大，解吸率越高。这可能是由于弱酸性条件下多酚类物质為分子形态，有利于其解吸；碱性条件下多酚类物质会带负电荷，与大孔树脂的结合力降低，也有利于解吸。酚类物质在酸性条件下比碱性条件更稳定，因此选择解吸剂pH值为5.0。

2.7 解吸剂体积对树脂解吸结合酚效果的影响

不同解吸剂体积下树脂解吸结合酚的效果如图6所示。

由图6可以看出：用pH值5.0的50%乙醇水溶液以1.0 mL/min的速度对紫薯结合酚进行解吸，当解吸液体积达到150 mL（即6.8 BV）以后，解吸率呈平缓升高趋势。因此，选择解吸体积为150 mL，此时解吸率达到81.45%±0.34%。

3 结论

HPD-100大孔树脂适于对紫薯结合酚进行纯化。吸附条件为：上样液浓度0.25 mg/mL、上样液pH值3.0、上样体积80 mL（即3.6 BV），吸附率达到78.08%±0.04%；解吸条件为：解吸剂用体积分数50%的乙醇水溶液（pH值5.0）、解吸体积150 mL（即6.8 BV），解吸率达到81.45%±0.34%。

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