国槐溃疡病致病菌砖红镰刀菌毒素的寄主专化性研究

李良壮 刘南南 袁凤英 王桂清

摘要：砖红镰刀菌为国槐溃疡病致病菌之一，深入研究砖红镰刀菌的致病机理及其毒素在致病过程中的作用具有重要意义。采用毒素浸种法，考察砖红镰刀菌毒素对国槐和其他19种植物种子萌发及根系生长的影响。结果表明：国槐种子的发芽势和发芽率随毒素浓度的增大而降低，即两者负相关；19种植物种子经毒素处理后，种子萌发和幼苗根系生长或被促进、或被抑制、或不受影响，即表现出多样性，说明砖红镰刀菌毒素为非寄主专化性毒素。该研究为国槐抗病品种选育和病害综合防控提供了新策略。

关键词：国槐；溃疡病；砖红镰刀菌；毒素；寄主专化性

中图分类号：S792.26；Q934.1 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2018）04-0015-04

国槐作为中国的原产树种，在园林绿化和药用油用、工业染料等领域发挥着重要作用，但病虫害的发生降低了其生态价值、经济价值和药用价值。国槐溃疡病是槐树苗期普遍发生的病害，主要由镰刀菌（Fusarium）和小穴壳菌（Dothiorella）引起。病原菌分泌产生的毒素被认为是与病程密切相关的一类致病因子，研究植物病原真菌毒素及其作用机理，对于了解植物与病原菌的互作机制具有十分重要的意义。聊城大学植物病理研究室从国槐苗期溃疡病株中分离鉴定到3种镰刀菌，分别为砖红镰刀菌（F. lateritium）、厚垣镰刀菌（F. chlamydosporum）和多隔镰刀菌（F. decemcellular）。本课题采用毒素浸种的方法，测定砖红镰刀菌毒素对国槐和其他19种不同植物种子及幼苗根系生理指标的影响，明确砖红镰刀菌毒素的寄主专化性类型，为深入研究砖红镰刀菌的致病机理和该病菌与国槐互作机制奠定了理论基础，也为植物的抗病品种选育和国槐溃疡病的防控提供了新策略。

1 材料与方法

1.1 供试菌种及培养

砖红镰刀菌，由聊城大学植物病理研究室提供。接种于PDA培养基，置于25±1 ℃的恒温培养箱内培养5 d，用打孔器制取0.7 cm的菌饼，备用。

1.2 毒素的制备与提取

将菌饼接入到已灭菌的100 mL PD培养液中，每瓶10个菌片。于25±1 ℃振荡培养7 d，真空抽滤，滤液于60±1 ℃条件下旋转蒸发浓缩，直到冷凝管中无水下滴为止，得到毒素粗提取物。

毒素提取原液用无菌三重水稀释，配制成系列浓度，即终浓度分别为0.100，0.033，0.020，0.014，0.011 g/mL，用于生物活性测定。

1.3 毒素生物活性的测定

1.3.1 供试种子 包括空心菜、白菜、苋菜、油菜、黄瓜、南瓜、西瓜、豆角、芸豆、黑豆、玉米、小麦、秋葵、番茄、辣椒、胡萝卜、三叶草、五彩石竹、向日葵、国槐等20种植物种子，购自聊城蔬菜花卉种子市场。

1.3.2 最适毒素浓度的选择 以国槐种子为材料，采用毒素浸种的方法，比较不同毒素浓度对种子萌发的影响，确定测定毒素生物活性的最适浓度。挑选大小均匀完整的种子，用2% NaClO溶液消毒3～5 min。分别用不同浓度的粗毒素浸泡24 h，以清水浸泡作对照，每个处理30粒种子，3次重复。将浸泡后的种子摆放在铺有2层滤纸的培养皿中，于25±1 ℃，RH 95%条件下保湿培养。观察7 d，记录种子萌发数，按照公式计算发芽率、发芽势及抑制率。

发芽势=■×100%

发芽率=■×100%

抑制势=■×100%

1.3.3 毒素专化性的测定 在最适毒素浓度下，采用浸种法，以19种不同植物种子为靶标，采用上述毒素处理方法，观察5 d，记录种子萌发数，计算发芽势、发芽率及抑制率；并采用Epson Perfection V700 Photo型根系扫描仪测定胚根长度、胚根投影面积等。

1.4 数据处理

利用Excel软件进行数据统计整理，经DPSv7.05统计软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 砖红镰刀菌毒素对国槐种子萌发的影响

国槐种子经不同浓度砖红镰刀菌毒素处理后的萌发情况见表1。

由表1可知：不同浓度的毒素处理对国槐种子的萌发具有显著影响，其发芽率、发芽势均随毒素浓度的降低而提高，即与毒素浓度呈负相关。当毒素浓度为0.100 g/mL时，国槐种子的发芽势与发芽率均为0，抑制率达100.00%；当浓度为0.020～0.033 g/mL时，发芽势抑制率为76.8%～92.25%，发芽率抑制率为58.67%～84.48%，均超过了50.00%；当浓度低于0.014 g/mL时，发芽势和发芽率的抑制率均低于50.00%。

毒素浓度过高，寄主种子全部不萌发；毒素浓度过低，寄主种子绝大多数萌发，显示不出差异。为了使毒素处理后的寄主种子的生理指标变化均有可比性，选择毒素浓度为0.020 g/mL进行专化性测定，当毒素浓度为0.020 g/mL时，发芽势和发芽率的抑制率均略超过50.00%，既不过高也不过低。

2.2 砖红镰刀菌毒素的专化性研究

2.2.1 砖红镰刀菌对19种植物种子萌发的影响 采用浸种法，用浓度为0.020 g/mL的毒素处理19种植物种子，不同种子的萌发情况见表2。

由表2可知：砖红镰刀菌毒素对19种植物种子萌发指标的影响表现出多样化。1） 对不同科植物种子萌发的影响趋势不同。对豆科、葫芦科、锦葵科、石竹科和菊科植物种子的发芽势和发芽率均表现为抑制作用，发芽势抑制率为3.80%～58.49%，发芽率抑制率为3.66%～39.16%。2） 对同科不同种的植物种子萌发趋势的影响也不同。用毒素处理十字花科的苋菜、白菜、油菜和空心菜等4种植物，对苋菜种子的发芽势表现为抑制作用，抑制率为6.71%；而对白菜、油菜和空心菜种子的发芽势则表现出促进作用，促进率为2.27%～15.46%。3） 对同种植物种子的不同萌发指标影响不同。对玉米种子的发芽势和发芽率均表现为抑制作用，抑制率分别为50.00%和25.29%；对白菜种子的发芽势和发芽率均表现为促进作用，促进率均为3.45%；对辣椒种子的发芽势表现为抑制作用，抑制率为3.40%，而对其发芽率则表现为促进作用，促进率为4.00%；对空心菜种子的发芽势表现为促进作用，促进率为15.46%，而对其发芽率则表现为抑制作用，抑制率为25.54%；对苋菜种子的发芽势表现为抑制作用，抑制率为6.71%，而對其发芽率无影响；对小麦种子的发芽势无影响，而对其发芽率表现为促进作用，促进率为1.12%。

2.2.2 砖红镰刀菌对19种植物幼苗根系的影响 砖红镰刀菌毒素对19种不同植物幼苗根系指标的影响见表3。

由表3可知：1） 砖红镰刀菌毒素对不同科的植物幼苗根系生长影响不同。对葫芦科、豆科、锦葵科、茄科和石竹科植物幼苗根系生长均表现为抑制作用，总根投影面积的抑制率为0～88.33%，胚根长度的抑制率为0.47%～42.86%；对十字花科、菊科和禾本科植物幼苗根系生长多表现为促进作用，总根投影面积的促进率为2.25%～20.46%，胚根长度的促进率为9.08%～55.11%。2） 对同科不同种的植物幼苗根系生长影响也不同。用毒素处理十字花科的苋菜、白菜、油菜和空心菜等4种植物，对空心菜幼苗的总根投影面积和胚根长度均表现为抑制作用，抑制率分别为2.36%和4.43%；而对苋菜和白菜幼苗的总根投影面积和胚根长度则表现为促进作用，促进率分别为13.42%～17.19%和9.08%～55.11%。3） 对同种植物的不同根系生长指标影响不同。对向日葵和玉米种子的胚根长度表现为抑制作用，抑制率分别为3.73%和11.61%；而对其总根投影面积表现为促进作用，促进率分别为20.46%和2.25%。

3 结论与讨论

选用PD培养液，采取浓缩浸提法，提取得到国槐溃疡病致病菌砖红镰刀菌粗毒素；采取毒素浸种法，测定砖红镰刀菌毒素对国槐及其他19种植物种子萌发和幼苗根系生长的影响。结果表明，国槐种子的发芽势和发芽率随毒素浓度的增大而降低，即两者负相关；19种植物种子经毒素处理后，种子萌发和幼苗根系生长或被促进、或被抑制、或无影响，即砖红镰刀菌毒素对不同植物种子萌发和幼苗根系生长的影响不同，表现出多样性，说明砖红镰刀菌毒素为非寄主专化性毒素。宋以星等人研究表明，经尖孢镰刀菌（F. oxysporum）毒素处理的大豆种子，随着培养时间的延长和处理浓度的升高，发芽率下降。本课题研究结果与之相一致。

植物病原真菌毒素根据其对寄主植物特异性作用差异可分为寄主专化性毒素（Host Specific Toxins，HST）和非寄主专化性毒素（Non-Host Specific Toxins，NHST）。寄主专化性毒素是直接决定植物病原真菌致病性的重要因素，对其寄主植物种类或者栽培品种具有特异性生理活性和高度专化性作用，链格孢属（Alternaria）、长蠕孢属（Helminthosporium）和镰刀菌属（Fusarium）等多种真菌均能产生寄主专化性毒素。镰刀菌是侵染多种农作物和经济作物的重要病原菌，其分泌产生的毒素可造成植物萎蔫、根腐、穗腐等腐烂病，导致作物品质下降和严重减产。镰刀菌属产生的毒素种类很多，其中主要是玉米赤霉烯酮、单端孢霉毒素、串珠镰刀菌素和伏马菌素等。

植物病原真菌毒素在植物病害的发生过程中起着重要作用，对寄主的破坏作用首先表现为影响细胞质膜系统，使电解质渗漏增加，当细胞遭受病原真菌伤害时，毒素即与细胞质膜的一种蛋白质结合，使膜结构发生变化、膜的细胞改变、电解质外漏、电导值增加。寄主的抗病性不同，对真菌毒素的耐受力也不同，抗病品种具有使体内病原真菌毒素降解的特性。植物病原真菌毒素尤其是非寄主专化性毒素，对寄主植物的作用强度与品种抗性有关，因此可广泛应用于诱变育种和选育抗病品种。

目前关于国槐致病菌毒素的研究较少，本课题仅对致病菌之一的砖红镰刀菌毒素的寄主专化性进行了初步研究，将进一步开展国槐病害致病菌毒素的结构、种类及数量在病菌侵染国槐时起到的作用及机制与国槐抗性的关系等研究，明确国槐病害的致病机理，为其抗病品种选育和综合防控提供新策略。

参考文献

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