珍珠龙胆石斑鱼低温有水保活条件优化

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(广东海洋大学食品科技学院,广东省水产品加工与安全重点实验室,广东省海洋食品工程技术研究中心,水产品深加工广东普通高等学校重点实验室,广东湛江 524088)

珍珠龙胆石斑鱼(♀Epinephelusfuscoguttatus×♂Epinepheluslanceolatus)属鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、斑鱼属(Epinephelus),主要分布于我国东南沿海,是目前养殖的主要品种之一,且营养丰富,是一种暖水性的大中型海洋高档名贵鱼类[1],深受消费者和养殖者青睐[2],但因分布地区的局限性,难以满足实际需求,而且其性格暴躁,背部和腹部有尖刺,运输过程中环境的变化会使其产生应激反应,剧烈挣扎,易受伤[3]。对其保活运输的研究报道较少,田朝阳[4]通过运输机组对石斑鱼的长距离运输技术进行了研究,存活时间长达48 h,成活率100%,但技术参数要求高。

对鱼类保活运输的研究表明:低温条件下,可使鱼类达到休眠或深度镇静状态,使鱼体内各种酶的活性降低,进而降低应激反应和新陈代谢水平,从而减缓水质恶化及运输过程中带来的机械损伤[5-6],从而达到延长鱼类存活时间、改善运输后鱼体品质的目的。Jag等[7]指出,在水温较低的条件下,鱼类的活动量大大减少,能减缓鱼类的代谢作用。刘伟东[8]在低温有水条件下对大菱鲆的存活时间进行研究,结果表明大菱鲆有水保活72 h成活率达到100%,但未提及保活密度。白艳龙[9]对黄颡鱼的低温无水保活进行了研究,结果表明:暂养48 h后,在低温充氧条件下可保活24 h。由此可见保活密度、温度、暂养等对鱼类的保活运输具有重要影响,对其研究具有重要意义。本文以珍珠龙胆石斑鱼为研究对象,探讨了不同温度、暂养时间、保活密度、降温模式等条件对石斑鱼保活的影响,确定了最佳的保活条件,以期为石斑鱼成鱼的保活运输奠定基础,同时为我国海水鱼成鱼的保活运输提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

珍珠龙胆石斑鱼(♀Epinephelusfuscoguttatus×♂Epinepheluslanceolatus) 湛江市水产市场,体表无损伤,健康无病害,体重为480～510 g/尾,充氧带水运输至实验室;白蛋白、球蛋白、皮质醇、血糖、甘油三脂、谷丙转氨酶、天冬氨酸转氨酶、尿素氮、肌酐试剂盒 南京建成生物工程研究所;纳氏试剂 生化试剂,天津久木科技有限公司;四水合酒石酸钾钠、氯化铵 分析纯,西陇科学股份有限公司;MS-222麻醉剂 分析纯,上海源叶生物科技有限公司。

FIM-120G颗粒制冰机 上海弗格森制冷设备有限公司;Cary 60 紫外分光光度计 安捷伦科技有限公司;5810R 台式高速大容量离心机 艾本德中国有限公司;Var i oskan 全自动酶标仪 塞默飞世尔科技中国有限公司;PB-10 pH计 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;DDS-307A 电导率仪雷磁 上海仪电科学仪器股份有限公司;电子称 广东香山衡器集团股份有限公司;冷风式冷库机组 东莞市科安制冷设备有限公司,温度范围4～25 ℃。

1.2 实验方法

1.2.1 石斑鱼的前处理 本试验在2017年7月进行。珍珠龙胆石斑鱼自市场购买回来后,置于暂养池中,鱼体暂养密度50 g/L,海水盐度23‰～25‰,水温23～25 ℃,采用砂滤循环海水(1100 L/h),空气泵充氧(100 L/min),保证水体溶解氧为5～8 mg/L,暂养一定时间后用于试验。

1.2.2 单因素实验 珍珠龙胆经过一定暂养时间后,以不同的降温模式降至休眠状态,转移到50 L的塑料箱中,每箱2尾鱼,每组三个重复,共6尾鱼,在一定温度,一定鱼密度,一定盐度条件下进行试验,分别记录存活时间。试验过程均采用空气泵充氧,简易循环水系统加过滤棉净化海水。

1.2.2.1 不同温度对石斑鱼存活时间影响 将暂养24 h休眠状态的石斑鱼按保活密度为100 g/L加入盐度为25‰新鲜海水,调节冷库温度为13、15、18、20、25 ℃,记录存活时间。

1.2.2.2 不同保活密度对石斑鱼存活时间的影响 将暂养24 h休眠状态的石斑鱼按保活密度为100、133、200、333 g/L分别加入盐度为25‰的新鲜海水,在水温为15 ℃条件下进行保活,分别记录存活时间。

1.2.2.3 不同降温模式对石斑鱼保活时间的影响 取暂养24 h、健康无病的石斑鱼，分别采用直接降温(30 min内降至休眠温度)、匀速降温(2 ℃/h)降至休眠状态、梯度降温(水温26～20，3、20～15，2、15～10 ℃，1 ℃/h)、在水温15 ℃，鱼密度为100 g/L条件下进行保活，分别记录保活时间。

1.2.2.4 不同暂养时间对石斑鱼存活时间的影响 取分别暂养0、24、48 h的石斑鱼,经低温诱导休眠后按保活密度为100 g/L条件下进行试验,在海水盐度为25‰,水温为15 ℃条件下进行保活,分别记录存活时间。

1.2.2.5 不同盐度对石斑鱼存活时间的影响 将暂养48 h休眠状态的石斑鱼按保活密度100 g/L分别加入不同盐度(15‰、25‰、35‰)的新鲜海水,在水温为15 ℃条件下进行保活,分别记录存活时间。

1.2.3 正交试验 选择暂养48 h,海水盐度为25‰,通过不同的保活温度、保活密度、降温模式进行三因素三水平正交试验,如表1所示,以存活时间和水中氨氮浓度作为指标进行单因素方差分析,确定最佳保活条件,并对最佳保活条件进行验证,分别测定石斑鱼在最佳保活条件下的存活时间,水质(pH、电导率、总氨氮含量、非离子氨氮浓度)及血清生理生化指标的变化。

表1 正交试验因素水平设计Table 1 Orthogonal experimental factors and levels design

1.2.4 存活时间 从低温诱导休眠至死亡前的这段时间记为存活时间,期间每隔4～6 h观察一次,通过刺激鱼体观察有无反应或者将鱼体放入常温海水中30 min观察鱼鳃盖是否开闭,判断鱼体是否死亡。

1.2.5 水质指标的分析方法 保活过程水体pH采用pH计监测;电导率仪测定水体电导率;海水中的总氨氮浓度的测定按照GB3097-1997《中华人民共和国海水水质标准》[10],采用纳氏试剂法测定。非离子氨氮采用计算法[11]。

1.2.6 血液生化指标的测定 将鱼体从保活箱中快速捞起,投入到浓度为200 mg/L的MS-222麻醉液中,麻醉后用10 mL的一次性无菌注射器(预先用质量百分比1%肝素钠溶液浸润内壁和针头)尾动脉抽血,抽血后注入到肝素钠抗凝的采血管中,缓慢摇晃均匀,4 ℃下3000 r/min离心20 min,取其血清,乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)均采用试剂盒测定;皮质醇含量用酶联免疫法测定;采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测血清中葡萄糖(GLU)的含量。

1.3 数据处理

使用 SPSS 19.0 软件对实验结果进行分析,在单因素方差分析(ANOVA)的基础上采用最小极差法(LSD)进行组间比较,取p<0.05 为差异显著,利用Excel 2007软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同温度对珍珠龙胆石斑鱼存活时间的影响

由图1可以看出,石斑鱼在温度为13 ℃条件下存活时间低于24 h;在15～25 ℃之间,随着保活温度的上升,存活时间下降,在15 ℃时存活时间最长达到128 h,且15、18、20 ℃组间存活时间无显著差异(p>0.05);在25 ℃时存活时间降至85 h。温度是活鱼运输的重要影响因素之一,适当的低温环境可减少鱼体的耗氧量、降低其新陈代谢、减轻水质恶化、提高成活率、延长存活时间[8,12]。但温度过高不利于石斑鱼的生存,原因是温度过高会使低温休眠后的石斑鱼代谢紊乱,温度过低会影响部分与其生命活动相关的酶的活性,进而影响存活时间。因此15～20 ℃是适合珍珠龙胆石斑鱼的保活温度。Golombieski 等[13]研究发现在15 ℃条件下运输银鲶鱼的存活率明显高于20 ℃和25 ℃下的,与本研究结果相似。

图1 不同保活温度对珍珠龙胆石斑鱼存活时间的影响Fig.1 Effect of preservation temperature on the srvival time of grouper注：不同小写字母表示差异显著(p<0.05);图2～图5同。

2.2 不同保活密度对珍珠龙胆石斑鱼存活时间的影响

由图2可以看出,珍珠龙胆石斑鱼的成活率随保活密度的减小而增大,与张丽[14]对大黄鱼保活运输及冰鲜的研究结果一致。在保活密度为333 g/L存活时间显著下降至最低60 h,保活密度在100、133、200 g/L下存活时间无显著差异,但在100 g/L保活密度下存活时间最长,达到112 h,原因是保活密度较小的情况下可以减缓鱼类的应激反应,防止因代谢紊乱而死亡,同时能够达到稀释水中氨氮浓度的作用,防止鱼体氨氮中毒,进而达到延长存活时间的效果。因此100～200 g/L保活密度适合珍珠龙胆石斑鱼的保活运输。

图2 不同保活密度对珍珠龙胆石斑存活时间的影响Fig.2 Effect of preservation densityon the survival time of grouper

2.3 不同降温模式对珍珠龙胆石斑鱼存活时间的影响

由图3可以看出，采用直接降温模式的石斑鱼保活时间最短，仅有52 h，而匀速将温模式和梯度降温模式可长达130 h以上，且无显著性差异。原因是温度的剧烈变化直接影响机体的代谢活动，间接支配着鱼体的生活和生存[12]。采用梯度降温与匀速降温模式的两组保活时间相差不大，是因为水温的缓慢变化使鱼体有一个适应的过程，不至于代谢紊乱，进而延长存活时间。

图3 不同降温模式对珍珠龙胆石斑鱼存活时间的影响Fig.3 Effect of different cooling modeson the survival time of pearl gentian grouper

2.4 不同暂养时间对珍珠龙胆石斑鱼存活时间的影响

由图4可以看出,石斑鱼的存活时间随暂养时间的延长而延长,暂养0 h条件下存活时间显著低于暂养48 h。暂养24、48 h组间无显著差异,但暂养48 h后的存活时间达到最大值132 h。原因是通过暂养可使鱼体内的代谢废物大幅度减少,从而减缓水质的恶化,而且可以缓解鱼体应激反应,延长存活时间[3]。暂养24～48 h的石斑鱼存活时间延长至96～132 h,存活96 h前水体较为清澈,但96 h之后,鱼体分泌蛋白粘液增多,水体中泡沫增加,影响鱼的呼吸。因此暂养24～48 h适合珍珠龙胆石斑鱼的保活研究。Berka[15]认为,活鱼运输前应停食1 d以上,运输时间可提高1倍。刘淇等[16]研究暂养时间对牙鲆无水保活时间的影响,结果表明不经暂养的牙鲆保活时间仅有32 h,而暂养48 h后,保活时间可提高到64 h。

图4 不同暂养时间对珍珠龙胆石斑鱼存活时间的影响Fig.4 Effect of holding time on the survival time of grouper

2.5 不同盐度对珍珠龙胆石斑鱼存活时间的影响

由图5可以看出,珍珠龙胆石斑鱼在盐度25‰的水体中存活时间最长,达到132 h,而在15‰,35‰盐度的水体中存活时间均显著降低(p<0.05)。这与鱼类的适应环境能力有关,珍珠龙胆石斑鱼适应盐度范围为11‰～41‰,最适生长盐度范围为25‰～35‰,低于5‰出现死亡[17]。当水体盐度低于25‰或高于35‰时,鱼体受到胁迫产生应激反应,导致存活能力下降。因此,珍珠龙胆石斑鱼保活运输的最适水体盐度为25‰。研究发现鲤鱼使用含9 g/L NaCl的水运输可明显提高运输存活率[18],大量研究表明在运输水中适当添加盐有利于淡水鱼运输[19-20];但Gomes等[21]研究发现巨舌滑鱼幼鱼在塑料袋包装运输时添加NaCl不仅没有减少应激还导致渗透压调节障碍。因此改变水体盐度的运输方法并不适合海水鱼类运输。

图5 不同盐度对珍珠龙胆石斑鱼存活时间的影响Fig.5 Effect of different salinity on the survival time of grouper

2.6 正交试验结果

通过正交试验以存活时间作单因素方差分析可知(见表3),保活温度与保活密度对存活时间具有显著性影响(p<0.05),而降温模式对存活时间无显著性影响(p>0.05)。对存活时间的影响A(保活温度)>B(保活密度)>C(降温模式),根据均值(见表4)确定最佳水平为:A1B1C2,即:保活温度15 ℃,保活密度100 g/L,降温模式为梯度降温。

表2 正交试验表设计与实验结果Table 2 Design of orthogonal experimental table and experimental results

表3 方差分析表(因变量:存活时间)Table 3 ANOVA table(dependent variable:survival time of grouper)

表4 存活时间的因素统计表Table 4 Estimates of factors for survival time of grouper

通过正交实验以水中总氨氮浓度单因素方差分析可知(见表5),保活温度、保活密度与降温模式对保活水体总氨氮浓度均具有显著性影响(p<0.05)。对保活水体总氨氮浓度的影响A(保活温度)>B(保活密度)>C(降温模式)。根据均值(见表6)确定最佳水平为:A1B1C2,即:保活温度15 ℃,保活密度100 g/L,降温模式为梯度降温。

表5 方差分析表(因变量:总氨氮浓度)Table 5 ANOVA table(dependent variable:Total ammonia nitrogen concentration of water)

表6 总氨氮含量的因素统计表Table 6 Estimates of factors for total ammonia nitrogen content of water

综合存活时间和总氨氮浓度的单因素方差分析结果,以及各因素间的显著性关系,选择条件为A(保活温度)15 ℃,B(保活密度)100 g/L,C(降温模式)梯度降温进行后续实验。

2.7 最佳条件的验证实验

对正交试验结果进行验证,珍珠龙胆石斑鱼经过梯度降温降至休眠状态,转移到15 ℃,保活密度为100 g/L条件下进行保活试验,保活过程中采用充空气(100 L/min)、过滤循环水(1100 L/h)。记录存活时间,结果表明:该条件下石斑鱼存活时间可达(168±8) h,保活72 h后水中总氨氮含量为(7.28±0.06) mg/L。

2.8 珍珠龙胆石斑鱼低温有水保活过程中水质指标的变化

由图6可以看出,在低温有水保活过程中,水体的pH在前24 h内略有降低,在保活48 h时,pH达到最低点,随后pH持续升高最终趋于稳定,但在0～96 h内水体pH无显著性变化(p<0.05),这与梁养贤[22]模拟草鱼长途运输的研究结果相似。国家渔业水质标准规定,海水鱼的水质pH应控制在 7.0～8.5[23],因此该保活条件下水质pH的变化对石斑鱼存活时间影响不大。水体的电导率随保活时间的延长呈增加趋势,在0～96 h内增长缓慢,且无显著性差异,表明珍珠龙胆石斑鱼在保活过程中由于代谢产物的积累造成水中盐类物质含量增加,从而电导率升高。

图6 水体pH、电导率、总氨氮浓度和非离子氨氮浓度随珍珠龙胆石斑鱼保活时间的变化Fig.6 The changes of water pH,conductivity,total ammonia nitrogen concentration and non-ionic ammonia nitrog en concentration with the survival time of the pearl gentian grouper

水体总氨氮随保活时间的延长而显著上升,在0～48 h内水体总氨氮浓度增加缓慢,由于总氨氮浓度的积累,在保活48～96 h范围内水体总氨氮浓度上升迅速,在72、96 h分别达到7.28、10.31 mg/L。水体总氨氮浓度是影响石斑鱼存活时间的主要因素之一,水体总氨氮浓度的增加,导致鱼体的存活时间减短[24]。温度为15 ℃、保活密度为100 g/L条件下氨氮浓度增长缓慢,由此可见低温可以降低鱼体的代谢活动,从而降低水中氨氮浓度,有利于延长存活时间。非离子氨氮浓度在0～48 h无显著变化,48 h后显著上升(p<0.05)。氨氮具有神经毒性,会引起鱼类在运输过程中惊厥、昏迷甚至死亡[25]。本研究中,珍珠龙胆石斑鱼保活96 h后水体非离子氨氮浓度为0.19 mg/L,远超出《海水水质标准》(GB 3097-1997)中的0.02 mg/L,表明珍珠龙胆石斑鱼在保活过程中能够耐受短时高浓度的非离子氨氮。

2.9 珍珠龙胆石斑鱼低温有水保活过程中血清生化指标的变化

鱼类的血清学指标是测定其健康状况、营养水平、疾病预防等方面的重要参考依据[26]。珍珠龙胆石斑鱼经过低温有水保活不同时间后血清生化指标的变化见表7,血清中的总蛋白(TP)主要包括白蛋白(Alb)和球蛋白(Glb),白蛋白主要由肝脏合成,有维持血浆渗透压、参与机体免疫、运输、营养等功能,球蛋白由淋巴细胞转化成的浆细胞分泌形成的,在机体的特异性免疫中发挥重要作用,血清总蛋白和白蛋白检测大都可以反映慢性肝损害及肝实质细胞的储备功能。由表7可以看出石斑鱼在保活过程中血清生化指标中的白蛋白在72 h内变化无显著性差异(p>0.05);TP在0～72 h内呈现先下降后上升的波动状态,在保活24 h后有显著降低,48～72 h逐渐上升,72 h时显著高于0 h(p<0.05),与白艳龙[9]对黄颡鱼无水保活技术研究的结果一致,说明珍珠龙胆石斑鱼在低温保活过程中机体免疫水平受到应激作用先下降后逐渐恢复,并在72 h后达到新的水平。通过机体特异性免疫免疫作用抵抗机体在保活过程中的低温、饥饿及水质恶化等多因素的应激作用。

表7 珍珠龙胆石斑鱼保活不同时间后血清生化指标的变化Table 7 Changes in serum biochemical indicators after different keeping alive time of grouper

皮质醇是应激反应系统中,最后分泌的一种激素,皮质醇的分泌能释放氨基酸、葡萄糖以及脂肪酸,这些被输送带血液里充当能量使用,同时皮质醇能促进糖的合成和脂肪的降解,这些过程产生的能量可以供给机体抵抗饥饿和水质恶化的胁迫,增加机体获得生存的机会[24],皮质醇、血糖常被作为应激反应的敏感指标,可以反映鱼类应激反应的强弱。Zhao[27]等在大口鲈鱼的运输研究中表明低温能显著降低水体的总氨氮含量与血清皮质醇含量,降低鱼体的应激反应。珍珠龙胆石斑鱼在低温有水保活48 h内血清皮质醇浓度显著下降,而72 h后恢复至保活前水平,表明在该条件下能有效降低鱼体的应激反应。应激反应是一种耗能过程,会导致血糖水平的变化,因此血糖水平常被作为可靠的生理应激指标之一。一些研究表明冷应激会导致鱼体血糖水平急剧升高。血糖(Glu)作为主要的能源物质,由表7可以看出珍珠龙胆石斑鱼在保活过程中血糖浓度上升,在48 h显著高于保活前水平(p<0.05),这与尤宏争[28]的研究结果相似,原因是由于饥饿胁迫或环境应激导致鱼体代谢活动增强,所需能量增多,肝糖原分解加速使血糖含量增加[23]。

甘油三酯(TG)的主要功能是供能与储存能源,还可以固定和保护内脏,其合成的原料之一是脂肪组织。由表7可以看出石斑鱼在保活72 h内,血清中甘油三酯的含量无显著性差异(p>0.05),72 h后其含量略高于初始值,表明脂肪在缓慢代谢。

血清尿素氮(BUN)是机体内蛋白质代谢的最终产物,主要经肾脏从尿液中排泄,肾脏受到损失,血尿素的含量会增加,因而尿素可以作为肾脏功能的评价指标之一[9]。该条件下石斑鱼在保活72 h内BUN与初始值相比无显著性差异(p>0.05),说明在该条件下的保活过程中鱼体的肾脏并未受到损伤。

谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)是参与机体蛋白质代谢的酶,当机体各组织器官或病变时,就会把其中的ALT释放到血液中,使血清ALT含量增加[29]。AST是肝脏中连接糖、脂质、蛋白质代谢的重要酶,正常情况下血清 AST 活性很低而且相对稳定,是肝脏病变程度的重要指标,正常情况下这些血清酶活性较低且相对恒定,当肝脏受到损伤时血清 AST 活性会升高[30]。由表7可以看出,石斑鱼在保活24 h后ALT含量显著高于初始值,48 h时达到最大值,48 h和72 h时都显著高于初始值(p<0.05),且两者之间无显著性差异,AST含量在石斑鱼保活24 h时有所降低,随后逐渐升高,48 h时达到最大值,72 h时略有降低,它们之间均无显著性差异(p>0.05)。这表明在保活过程中低温和饥饿的胁迫作用使鱼体的肝脏有所损伤。

乳酸脱氢酶(LDH)是糖代谢中催化丙酮酸向乳酸转化的酶,是心肌梗代谢情况的主要指标酶之一。心肌梗死、肌肉损伤都会导致 LDH 的升高[23]。由表7可以看出石斑鱼在保活24 h时LDH含量显著降低,随后增长至稳定水平,且与初始值无显著性差异(p>0.05),这说明该条件下石斑鱼进行有氧呼吸且肌肉未损伤,心肌功能正常。

3 结论

珍珠龙胆石斑鱼暂养48 h后,采用平均1～2 ℃/h的梯度降温模式降到休眠状态,在水温15 ℃、保活密度100 g/L、盐度25%的条件下保活,存活时间可达(168±8) h;随着保活时间的延长,水质总氨氮浓度逐渐增加,保活72 h后水体总氨氮浓度为(7.28±0.06) mg/L,pH无显著变化,电导率随时间延长而增加但无显著变化。血糖在保活过程中显著上升,而血清皮质醇浓度在72 h恢复到正常水平,白蛋白与甘油三酯无显著变化,总蛋白与尿素氮在72 h后恢复正常水平。AST和LDH无显著变化,ALT显著上升,表明鱼体在低温保活过程中由于环境胁迫导致血清生化指标发生变化,但在72 h内机体能通过代谢酶的调节达到新的平衡状态。对珍珠龙胆石斑鱼在保活运输过程中的应激与代谢变化还有待进一步深入研究。