响应面法优化‘凤丹’牡丹花瓣多酚提取工艺

,, ,雅君, ,丽培,

(1.郑州师范学院 河南郑州 450044;2.河南职业技术学院 河南郑州 450046)

牡丹籽油在2011年被认定为新资源食品,‘凤丹’牡丹(Paeoniasuffruticosa‘Feng Dan’)是榨取牡丹籽油常用的品种之一,随着牡丹籽油的急性肝损伤保护[1]、抗糖尿病[2]、降血脂[3]、降血糖[4]、防晒[5]等保健功能[6]逐渐被人们重视,其种植面积将逐年扩大。‘凤丹’牡丹花量较大,应将过多的花疏除，以保证牡丹籽的饱满程度与产量,疏除后的未完全盛开的牡丹花干化后可泡茶饮用。多酚是一种常见的生物活性物质,相关研究文献[7-8]较多,近来还发现多酚对阿尔茨海默病[9]、体外抗脂质过氧化[10]等有一定作用,也有文献表明芍药花[11]与灰树花[12]的多酚均有特殊功能。超声提取技术是利用超声波的机械效应、空化效应和热效应来增大介质分子的运动速度,增大介质的穿透力以提取生物有效成分[13],与常见的溶剂萃取法、超临界萃取和高压快速提取技术相比,超声提取法具有操作简便、安全、成本低、提取时间短、提取率高等特点[14],目前已经广泛运用到多种植物如葡萄[15]、石榴[16]、苹果[17]、板栗[18]的特定组织多酚的提取。响应面法是一种成熟的优化若干个因素组合，以达到响应值最大化的常用方法,在蒲公英[19]、核桃枝[20]、三七[21]、栀子[22]等多酚的提取工艺优化中已有较好的应用。

国内外暂无牡丹花瓣多酚提取的相关研究,本研究拟以响应面法优化‘凤丹’牡丹花瓣多酚的超声提取工艺,以期为‘凤丹’牡丹副产物的综合利用与牡丹产业的深层次发展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

‘凤丹’牡丹花 以2016年5月采摘的六年生实生苗‘凤丹’牡丹花瓣为试验材料,每株取1～2朵花,每朵取花瓣1～2瓣,挑选无病虫害,生长正常,大小一致,无明显机械伤的花瓣放于冰盒，于4 h内运至实验室,放置于4 ℃冰箱保存备用。没食子酸 上海圻明生物科技公司;福林酚试剂 上海荔达生物科技有限公司;无水碳酸钠等 均为分析纯。

T6型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;TH-250B型数控超声波清洗机 济宁天华超声电子仪器有限公司;FOSS SCINO CT410旋风式粉碎磨 杭州嘉伟创新科技有限公司;DHG-9140型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;TGL16M冷冻离心机 湖南湘立科学仪器有限公司;JA3003N型电子天平 上海菁海仪器有限公司;BCD-216ZDJ型冰箱 青岛海尔股份有限公司;MINI型超纯水机 湖南科尔顿水务有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理方法 将‘凤丹’牡丹花瓣置于80 ℃恒温干燥箱中烘干至恒重,取出后置于旋风式粉碎磨，制粉,过100目筛后，置于棕色磨砂广口瓶内并密封,4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 单因素实验 设定超声时间35 min,超声功率80 W,乙醇体积分数70%时,分别用30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1 mL/g的液料比提取花瓣多酚,考察液料比对花瓣多酚提取的影响。

设定液料比50∶1 mL/g,超声功率80 W,乙醇体积分数70%时,分别用5、20、35、50、65 min的超声时间提取花瓣多酚,考察超声时间对花瓣多酚提取的影响。

设定液料比50∶1 mL/g,超声时间35 min,乙醇体积分数70%时,分别用60、70、80、90、100 W的超声功率提取花瓣多酚,考察超声功率对花瓣多酚提取的影响。

设定液料比50∶1 mL/g,超声时间35 min,超声功率80 W时,分别用体积分数为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液提取花瓣多酚,考察乙醇体积分数对花瓣多酚提取的影响。

1.2.3 响应面法优化提取多酚 在单因素实验基础上,以液料比、超声时间、超声功率和乙醇体积分数为自变量,以‘凤丹’牡丹多酚含量为响应值,设计4因素3水平的响应面分析试验,从而得到最佳提取工艺。四个因素的编码水平见表1。

根据表1的自变量编码水平,设计响应面分析试验,见表2,共29个试验点,其中5个为中心点,在各个影响因素均为零水平的基础上重复5次试验,用来估计试验误差,其它的24个试验点为析因点,用来分析A液料比、B超声时间、C超声功率、D乙醇体积分数四个因素对‘凤丹’牡丹花瓣多酚含量的影响。

表1 自变量因素编码及水平Table 1 Independent variable codings and levels

1.2.4 多酚含量的测定

1.2.4.1 没食子酸标准曲线的制作 参考蔡庆生[23]的方法,配制浓度为0.05 mg/mL的没食子酸标准液。分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的没食子酸标准液于试管,分别加入蒸馏水6、5.8、5.6、5.4、5.2、5.0 mL,加入福林酚试剂1 mL,最后加入3 mL 7.5%的碳酸钠溶液。充分摇匀后静置反应2 h。在765 nm测定吸光值,同时做空白对照,并计算得线性回归方程:y=0.0148x-0.0186,R2=0.9979,其中y为吸光度值,x为没食子酸含量(μg/mL),试验结果显示没食子酸含量在10～50 μg/mL之间与吸光值有良好的线性关系。

1.2.4.2 样品多酚含量的计算 根据标准曲线计算每克样品中多酚含量。

式中,m为根据标准曲线计算的多酚的质量(mg);V0为多酚提取液的体积(mL);N为提取液稀释倍数;V为多酚提取液总体积(mL);W为所取样品的质量(g)。

1.3 数据统计与分析

数据采用Microsoft office Excel 2010进行计算并作图,采用软件Design-Expert 7.0以‘凤丹’牡丹花瓣多酚含量为响应值,进行多元回归分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 液料比对多酚含量的影响 由图1可知,随着液料比的增加,多酚的含量先增大,说明增大溶剂的体积利于花瓣中多酚的溶出,当液料比增加至40∶1 mL/g时,多酚含量达到最大值,当液料比超过40∶1 mL/g时,多酚含量开始下降,说明多酚在提取液中已经达到饱和并有分解或破坏趋势,这与李娜等[24]、伍春等[25]的研究结果一致。另外,液料比过大会造成试剂浪费,综合考虑，确定适宜提取液料比为40∶1 mL/g。

图1 液料比对牡丹花瓣多酚含量的影响Fig.1 Effect of liquid to solid ratio on the extraction of polyphenols

2.1.2 超声时间对多酚含量的影响 由图2可知,花瓣多酚含量在35 min时达到最大值,在此之后随着时间的增加，多酚含量呈现下降趋势,原因可能是随着超声时间的延长,超声震动使提取溶液温度升高,在达到一定温度时破坏了多酚结构,使多酚发生降解等反应[26],从而导致‘凤丹’牡丹花瓣多酚含量降低。因此,将35 min作为提取‘凤丹’牡丹花瓣多酚的适宜提取时间。

图2 超声时间对牡丹花瓣多酚含量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction of polyphenols

2.1.3 超声功率对多酚含量的影响 由图3可知,超声功率在60～100 W之间时,随着超声功率的增加,多酚的含量增大,当超声功率在70 W时,多酚含量达到最大,之后有所下降。在相同的时间内,超声波功率越大,升温越快,温度增高使固液扩散速度加快,有利于多酚成分的溶出[27],但当温度过高时,会破坏多酚的结构,使多酚发生降解反应,从而降低了多酚的含量。因此,提取‘凤丹’牡丹花瓣多酚的适宜超声功率为70 W。

图3 超声功率对牡丹花瓣多酚含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction of polyphenols

2.1.4 乙醇体积分数对多酚含量的影响 由图4可知,随着乙醇体积分数的增加，多酚含量呈现先升高后下降的趋势,在体积分数达到70%时,‘凤丹’牡丹多酚含量达到最大值。当乙醇的体积分数较低时，不足以破坏氢键或者破坏不够完全,从而减少多酚的溶出,使多酚的含量降低;当乙醇的体积分数过高时,降低了极性,从而影响多酚提取,使含量下降[28]。由图4可知多酚含量相对较高的乙醇体积分数范围在50%～70%之间。

图4 乙醇体积分数对牡丹花瓣多酚含量的影响Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on the extraction of polyphenols

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验 响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Response surface design and results

2.2.2 响应面模型建立与方差分析 建立以A、B、C、D为自变量的关于多酚含量Y的多元二次回归模型,用Design-Expert7.0软件对表2中29个响应值进行拟合,得到如下方程:

Y=51.632+1.622A-1.128B+1.839C+1.110D+0.012AB-0.984AC-0.302AD+0.929BC+0.140BD-0.029CD-1.130A2-1.370B2-2.967C2-1.514D2

由表3可得,模型极显著(p<0.01),失拟项p值为0.5806不显著,表明该方程具有较高的拟合度,试验误差小,该方程的一次项A、B、C、D和二次项A2、B2、C2、D2均表现出极显著差异(p<0.01),因素AC、BC差异极显著(p<0.01),AB、AD、BD、CD差异不显著(p>0.05)。由F值可知,四个因素对‘凤丹’牡丹花瓣多酚含量的影响依次为C(超声功率)>A(液料比)>B(超声时间)>D(乙醇体积分数)。综上所述此模型具有应用意义,可用于试验分析。

表3 回归方程系数显著性检验Table 3 Test of significance for regression equation coefficients

2.2.3 响应面曲面图分析 响应面曲面图和等高线图见图5,由每两种试验因素与响应值构成的曲面图,曲面图反映了四个变量因素液料比、超声时间、超声功率和乙醇体积分数,当其中任意两个变量取零水平时,另外两个因素对‘凤丹’牡丹花瓣多酚含量的影响。曲面图坡度越陡(即等高线越密集),说明条件变化对多酚含量的影响越大;若坡度较平缓(即等高线越稀疏),则条件变化对响应值的影响越小。等高线图是由多条封闭曲线构成,在同一条曲线上多酚的含量相同,在封闭曲线的中心多酚含量最高,越靠近外围多酚含量越低,由中心到边缘整体呈递减趋势。等高线图的封闭曲线越圆,表明这两种因素相互影响作用越小;若等高线越趋近于椭圆状,则说明这两种因素相互影响作用越大[29]。

根据以上响应曲面的特征,对图5所有曲面图进行分析,可得超声功率和液料比(图5b),超声功率和超声时间(图5f)之间存在显著的交互作用,其他因素交互作用不显著。由图5b可知,液料比较低时,等高线相对密集,说明在液料比低时,超声功率对多酚含量有显著影响,增大超声功率可以提高多酚含量。当超声功率到达一定值时,增大液料比对多酚含量的影响不大。由图5f可知,当超声时间比较低时,增大超声功率对提高多酚含量有显著影响,当超声时间达到一定值时,增大超声功率,多酚含量也不会明显提高。

图5 任意两个变量交互作用的响应曲面图Fig.5 Response surface diagram of interaction between two arbitrary variables注:a:超声时间和液料比的交互作用;b:超声功率和液料比的交互作用;c:乙醇体积分数和液料比的交互作用;d:乙醇体积分数和超声时间的交互作用;e:乙醇体积分数和超声功率的交互作用;f:超声功率和超声时间的交互作用。

2.2.4 提取多酚最佳组合工艺的确定及验证 对建立的二次回归方程求最大值,得到超声辅助提取‘凤丹’牡丹花瓣多酚的理论最佳工艺为:液料比43.05∶1 mL/g,超声时间29.9 min,超声功率71.5 W,乙醇体积分数62.9%。在此条件下,多酚的理论提取值为52.621 mg/g。考虑实际情况,调整液料比为43∶1 mL/g,超声时间为30 min,超声功率为72 W,乙醇体积分数为63%,以此为最佳工艺条件进行5次平行试验进行验证,测得‘凤丹’牡丹花瓣的多酚含量为(52.111±1.752) mg/g,与预测值的相对误差为0.969%,证明响应面优化得到的工艺条件准确可靠,可用于‘凤丹’牡丹花瓣多酚提取预测。

3 结论与讨论

以乙醇为提取溶剂,采用超声辅助法提取‘凤丹’牡丹花瓣多酚,在四个单因素试验的基础上,通过响应面试验设计建立多酚含量的多元二次回归方程模型,并对方程分析,优化出提取多酚的最佳工艺条件:液料比43∶1 mL/g,超声30 min,超声功率72 W,乙醇体积分数为63%,在最佳条件下,多酚含量为(52.111±1.752) mg/g,达到回归模型理论值(52.621 mg/g)的99.031%,相对误差值是0.969%,说明响应面法优化建立的回归方程模型科学可靠。