人参皂苷Rg3通过内质网应激PERK通路抑制人胆囊癌裸鼠移植瘤生长的研究

黄捷 吴可人 徐涛 金法 叶志鹏 阎九亮 李宁

胆囊癌是最常见的胆道恶性肿瘤之一，其致病原因尚不十分清楚，症状缺乏特异性，恶性程度高，进展快，转移早且预后不良，确诊时多属晚期[1-2]，开发抑制其生长和转移的药物已成为一项重要课题。人参皂苷Rg3是从中药人参中提取的单体成分，具有抑制肿瘤细胞生长、增殖，诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并能选择性抑制肿

瘤细胞转移、浸润及肿瘤新生血管的形成，还能明显提高化疗疗效[3-4]。本课题组前期研究证实，人参皂苷Rg3在分子水平上调C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous transcription factor，CHOP）表达并激活 Caspase12 依赖性细胞凋亡，抑制CHOP表达能够显著减弱人参皂苷Rg3对胆囊癌细胞的细胞毒性和促凋亡作用[5]。本研究拟通过观察人参皂苷Rg3对人胆囊癌细胞GBC-SD裸鼠移植瘤生长的作用，探讨人参皂苷Rg3通过内质网应激双链RNA依赖性蛋白激酶样内质网激酶（pancreatic ER stress kinase，PERK）通路抑制人胆囊癌裸鼠移植瘤生长的机制。

1 材料和方法

1.1 细胞来源 人胆囊癌细胞GBC-SD购自上海复祥生物科技有限公司，人胆囊癌细胞加入RPMI1640培养基中，放入37℃、5%CO2细胞培养箱培养。

1.2 实验动物 5周龄雄性BALB/c裸鼠12只，体重约20～23g，购于常州卡文斯实验动物有限公司，在浙江中医药大学动物实验中心SPF级动物房普通饲料喂养，自由饮水。

1.3 主要试剂和仪器 人参皂苷Rg3（美国Sigma-Aldrich公司，货号：SML0184）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo Scientific公司）；PERK抗体（英国Abcam公司）；磷酸化 PERK（p-PERK）抗体、β-actin 抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2 alpha，eIF2α）抗体（美国Proteintech 公司）；脂质运载蛋白 2（lipocalin 2，Lcn2）抗体、磷酸化 eIF2α（p-eIF2α）抗体、转录激活因子 4（activating transcription factor 4，ATF4）抗体（美国 Affinity Biosciences公司）；羊抗兔HRP标记二抗、羊抗鼠HRP标记二抗、RIPA裂解液（碧云天生物技术研究所）；Western blot实验设备（美国Bio-Rad公司）；酶标仪（MK3，芬兰雷勃公司）；成像系统（Tanon-5200，上海天能科技有限公司）；CO2细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司）；倒置拍照显微镜（德国Leica公司）。

1.4 动物模型建立 采用随机数字表法将裸鼠分为人参皂苷Rg3灌胃组和对照组各6只。取指数生长期人胆囊癌细胞GBC-SD，用PBS洗涤3次，重悬于PBS中并调整浓度为5×106/ml，于每只裸鼠右侧腹股沟皮下注射0.2ml细胞悬液（1×106/个人胆囊癌细胞GBC-SD），细胞悬液接种7d后，观察成瘤情况。待肿瘤长至50～70mm3开始进行灌胃处理，人参皂苷Rg3组将人参皂苷Rg3按20mg/kg剂量溶于0.2ml 0.9%氯化钠溶液后灌

胃，对照组用0.2ml 0.9%氯化钠溶液灌胃，1次/d，连续给药3周。

1.5 瘤体积和瘤体质量测量 灌 胃处理开始后每隔3d以游标卡尺测量肿瘤长、短径并计算瘤体积直至第21天灌胃结束，瘤体积＝（肿瘤长径×肿瘤短径2）/2。21d后处死小鼠，切除肿瘤并称重后，冻存组织以备后续实验。

1.6 p-PERK、PERK、p-elF2α、elF2α、ATF4 和 L cn2 蛋白表达水平检测 采 用Western blot法。取冻存组织按照RIPA裂解液说明书裂解，BCA法测定蛋白浓度，绘制标准曲线。灌制12%分离胶、5%浓缩胶的SDS-PAGE凝胶，样品蛋白（25～40μg/样品）通过 S DS-PAGE 电 泳，并转移到PVDF膜，PVDF膜孵育在含5%脱脂奶粉的封闭液平皿中（室温下30min）。将一抗稀释至适当浓度（PERK、p-PERK、elF2α、p-elF2α、ATF4、Lcn2、β-actin稀释度1∶1 000），加入封闭液中，4℃脱色摇床过夜，用TBST洗涤缓冲液在4℃下脱色摇床上洗涤，同上方法制备二抗稀释液（1∶5 000），4℃下孵育 4 ～5h后，用 T BST洗涤缓冲液在4℃下脱色摇床上洗涤。加入ECL发光液，曝光后用Image J软件分析，蛋白质的相对表达为每个蛋白与内参蛋白的灰度值的比值。

1.7 统计学处理 采 用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组裸鼠瘤体积和瘤体质量比较 人参皂苷Rg3灌胃组裸鼠瘤体质量明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。灌胃9d内，两组裸鼠肿瘤体积大小比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；但灌胃12d开始，人参皂苷Rg3灌胃组裸鼠瘤体积较对照组均明显减小，差异均有统计学意义（均P＜0.01），提示人参皂苷Rg3能抑制肿瘤体积增长，见表1。

2.2 两组内质网应激PERK通路相关蛋白表达水平比较 人参皂苷Rg3灌胃组裸鼠p-PERK、p-elF2α、ATF4和Lcn2蛋白表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；但两组裸鼠PERK和elF2α蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），提示人参皂苷Rg3能够激活内质网应激PERK信号通路，见表2和图1。

3 讨论

研究表明人参皂苷Rg3能够抑制多种肿瘤细胞的生长，但其作用机制尚不完全清楚[6-8]。本课题组前期研究表明，人参皂苷Rg3对原发性胆囊癌细胞具有显著的细胞毒性和促凋亡作用，但是对非癌胆囊上皮细胞无影响[5]。该研究证实人参皂苷Rg3在分子水平介导的病理性内质网应激可能是其对胆囊癌细胞作用的关键机制。本研究则通过检测人胆囊癌细胞裸鼠移植瘤组织中PERK 通路相关蛋白 p-PERK、PERK、p-elF2α、elF2α、ATF4和Lcn2的表达水平，探讨人参皂苷Rg3对胆囊癌细胞PERK通路的作用，结果表明人参皂苷Rg3通过PERK、elF2α磷酸化，增加了下游蛋白ATF4、Lcn2表达，证实内质网应激PERK通路的激活，并发挥抗肿瘤作用。

表1 两组裸鼠移植瘤体积与瘤体质量比较

表2 两组裸鼠内质网应激PERK通路相关蛋白表达水平比较

图1 两组裸鼠内质网应激PERK通路相关蛋白表达的电泳图

近年研究表明内质网应激PERK通路活化能够诱导多种肿瘤细胞凋亡[9-11]。PERK通路是未折叠蛋白反应信号通路的一个组成部分。在非内质网应激状态下，PERK与分子伴侣GRP78/Bip结合处于非活动状态；在内质网应激条件下，PERK与GRP78/BiP分离并被激活，PERK磷酸化后引起eIF2α失活，使细胞多数蛋白质的合成终止，进而调节细胞周期。PERK、eIF2α磷酸化同时激活ATF4，上调CHOP表达[12]。ATF4是碱性亮氨酸拉链家族的成员之一，在内质网应激状态下依赖PERK通路翻译，在综合应激反应通路的激活中起核心作用。在应激源作用下，eIF2α磷酸化后使ATF4进入细胞核内，激活下游基因表达[13]。在内质网应激相关内皮细胞凋亡的报道中均发现ATF4表达上调[14]。CHOP是内质网应激的一个特定转录因子，诱导内质网应激蛋白——细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因表达，与细胞周期调控相关[15]。此外，各类促细胞凋亡的研究中已有CHOP表达增加的相关报道[16]。

Lcn2也称为中性粒细胞明胶酶蛋白，在多种实体肿瘤中均有表达上调，并被证明与肿瘤进展相关[17-19]。研究表明在前列腺癌细胞中未折叠蛋白反应通过NF-κB依赖途径激活Lcn2表达，Lcn2在多种肿瘤细胞中表达可能伴随未折叠蛋白翻译活化，内质网应激/Lcn2可能是肿瘤发展过程中的一个潜在干预靶点[20]。另有研究表明在慢性肾功能不全时清蛋白通过升高胞质内钙浓度，诱导未折叠蛋白反应，通过ATF4、Lcn2表达诱导肾小管上皮细胞凋亡；同时，Lcn2基因抑制能够减轻内质网应激诱导的细胞凋亡，减轻蛋白尿小鼠的肾小管间质损伤，降低死亡率[21]。本研究也得出类似结果，人胆囊癌裸鼠移植瘤经人参皂苷Rg3处理后Lcn2蛋白表达显著升高。

本研究表明人参皂苷Rg3灌胃能明显抑制人胆囊癌裸鼠移植瘤的生长，同时人参皂苷Rg3没有增加PERK和eIF2α蛋白表达。人参皂苷Rg3灌胃组p-PERK、peIF2α、ATF4和Lcn2蛋白表达水平明显高于对照组，表明人参皂苷Rg3能引起PERK、eIF2α磷酸化并增加ATF4、Lcn2蛋白表达，证实人参皂苷Rg3在体内激活PERK通路的重要作用，人参皂苷Rg3在体内通过激活内质网应激PERK通路，抑制人胆囊癌裸鼠移植瘤生长。人参皂苷Rg3可以作为有前景的抗胆囊癌药物进一步研究，而人参皂苷Rg3促胆囊癌细胞凋亡的其他机制有待进一步深入研究。