来那度胺抑制小鼠Lewis瘤作用机制的研究

杨毅 郭丽 李文燕 韩晨阳

来那度胺是沙利度胺的衍生物之一，属于第二代免疫调节药物[1]。来那度胺能够调节细胞免疫和体液免疫，临床主要用于各种恶性血液系统疾病的辅助治疗，批准的适应证主要是骨髓增生异常综合征中的5q-综合征和多发性骨髓瘤。虽然后期在实体瘤的实验中发现，来那度胺可以抑制肿瘤血管的形成、增强体内免疫反应等[2-3]，但是在实体瘤的应用中始终具有一定的局限性。目前程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD1）抑制剂是肿瘤免疫抑制治疗的研究热点，PD1及其配体（PD1/PD-L1）作为免疫抑制的主要通路，在肿瘤免疫调节中发挥着重要作用。而前期研究中鲜有文献报道来那度胺对免疫抑制的调节作用，就肿瘤药物的研究，寻找一种既可以提高免疫功能又可以降低免疫抑制的药物是有积极意义的。本研究通过观察来那度胺对Lewis荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群/树突状细胞比例和PD1/PD-L1通路的影响，探讨来那度胺经免疫途径治疗实体瘤的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级近亲系C57BL/6J雄性小鼠40只，8～10周龄，体重18～22g，购于浙江中医药大学动物实验中心[实验动物许可证号为SCXK（浙）2013-0184）]，分笼饲养，每笼8只，共5笼。动物实验室温度为20～25℃，湿度为（70±5）%，依据国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，小鼠活动、摄食自由。

1.2 细胞株与试剂 Lewis肺癌细胞株购于武汉普诺赛生物技术有限公司。来那度胺购于武汉卡斯恩化工有限公司（医药级，货号15002719264），FITC标记的小鼠CD4、CD80抗体，PE标记的小鼠CD8、CD11c抗体购于美国Bio Legend公司。PD1、PD-L1的一抗和二抗购于美国Sigma公司。

1.3 来那度胺对细胞的毒性作用鉴定 Lewis肺癌细胞株进行贴壁培养，待对数生长期时消化得到细胞悬液，调整细胞悬液浓度为2×106/ml，在96孔板中每孔加入细胞悬液100μl，设置对照组和来那度胺组（浓度依次为 1、5、10、20、40、80μM），每组 5 个复孔分别培养24、48和 72h，CCK8法检测细胞活力，Hoechst 33258染色检测凋亡细胞。

1.3.1 CCK8法检测细胞活力 将细胞接种到96孔板中，待细胞贴壁后用不同终浓度来那度胺干预一定时间后，弃去培养基，加入100μl的新培养基和10μl的CCK8溶液继续孵育4h，同时设置空白培养基为对照，酶标仪检测细胞吸光度值（A），计算细胞活力。细胞活力=[（实验组A-空白对照A）/（对照组A-空白对照A）]×100%。

1.3.2 Hoechst 33258染色检测凋亡细胞 将细胞接种到24孔板中，待细胞贴壁后用终浓度为80μl的来那度胺干预一定时间后，弃去培养基，PBS洗2次后甲醇固定，加入Hoechst 33258染色液染色0.5h后，PBS洗3次后在镜下观察细胞，其中蓝色强荧光为阳性细胞，代表凋亡细胞。

1.4 小鼠造模和分组 取正常小鼠，在无菌条件下取对数生长期的Lewis肺癌细胞株进行接种，调整细胞悬液浓度为2×106/ml，在每只小鼠右侧腋窝下接种细胞悬液0.5ml，接种后常规饲养5d，选取荷瘤建模成功的小鼠分设模型组、来那度胺低剂量组（1mg/kg）和高剂量组（10mg/kg），另择正常小鼠设为对照组，每组10只。来那

度胺用0.9%氯化钠溶液配置成50mg/ml混悬液，低剂量组剂量为1mg/kg，高剂量组剂量为10mg/kg，对照组和模型组给予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃，均每天灌胃1次，连续14d，断颈处死，取肿瘤组织和外周血进行实验。

1.5 体内抑瘤率测定 实 验期间每日观察小鼠的生长期情况和肿瘤大小，给药14d后处死小鼠，解剖并分离肿瘤，对肿瘤进行称重，计算抑瘤率，抑瘤率=（模型组平均肿瘤重量-来那度胺组平均肿瘤重量）/模型组平均肿瘤重量×100%。

1.6 肿瘤细胞的分离 肿 瘤称重后，置于含有青霉素（100U）和链霉素（100μg/L）的培养基中浸泡 1 h，用无菌手术剪剪成小块，加入胶原蛋白酶Ⅳ和脱氧核糖核酸酶（浓度均为0.05%），消化后进行无菌铜网过滤，得到细胞悬液，1 500r/min离心10min得到细胞。

1.7 T淋巴细胞亚群/树突状细胞比例检测 采 用流式细胞术。将上述分离得到的肿瘤细胞和外周血细胞调节浓度为1×106/ml，分别分设3管，每管加入0.5ml细胞悬液（含5×105个细胞），离心后弃去培养基后用PBS调整总体积为 1 00μl，第 1管中加入 C D4和 C D8抗体0.5μl，第 2 管中加入 C D11c 和 C D80 抗体 0 .5μl，第 3管为空白对照，避光孵育0.5h，PBS洗2次后上机检测。

1.8 PD1/PD-L1蛋白表达水平检测 采用Western blot法。将分离得到的细胞调节细胞浓度为2×106/ml，用RIPA和PMSF提取细胞总蛋白。BCA法检测蛋白浓度。取蛋白质样品，与5×蛋白上样缓冲液混合，沸水煮5min变性，经SDS-PAGE，蛋白从凝胶中转移到PVDF膜上，含5%脱脂奶粉的TBST封闭2h。加入一抗，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，5min/次，加入HRP标记的二抗室温孵育2h，ECL显影，曝光后用Image J软件分析，蛋白质的相对表达为每个蛋白与内参蛋白的灰度值的比值。

1.9 统计学处理 采 用SPSS 13.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 来那度胺对Lewis肺癌细胞株的细胞毒性作用在不同浓度来那度胺干预24、48和72h后，Lewis肺癌细胞株均未出现细胞毒性反应，细胞活力均在95%以上。同一时间点不同浓度来那度胺组与对照组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），且不同浓度来那度胺组间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。Hoechst 33258染色也证明细胞无显著凋亡，提示来那度胺对Lewis肺癌细胞株无明显细胞毒性，见图1（插页）。

表1 不同浓度来那度胺干预后Lewi s肺癌细胞株的细胞活力（%）

2.2 来那度胺对Lewis荷瘤小鼠的抑瘤率 高剂量组、低剂量组肿瘤重量均低于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；高剂量组肿瘤重量低于低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。高剂量组抑瘤率高于低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。2.3 来那度胺对T淋巴细胞亚群/树突状细胞比例的影响 对于T淋巴细胞亚群，来那度胺可以提高肿瘤浸润组织和外周血中CD4+、CD8+比例。高剂量组、低剂量组CD4+、CD8+比例均高于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；且高剂量组 CD4+、CD8+比例高于低剂量组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。对于树突状细胞，来那度胺可以提高肿瘤浸润组织和外周血中 CD11c+、CD80+及两者双阳性 （CD11c+CD80+）比例。高剂量组、低剂量组 CD11c+、CD80+、CD11c+CD80+比例均高于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而低剂量组和高剂量组 CD11c+、CD80+和 CD11c+CD80+比例比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

表2 来那度胺对Lewi s荷瘤小鼠的抑瘤率

表3 来那度胺对肿瘤浸润组织和外周血中T淋巴细胞亚群/树突状细胞比例的影响

2.4 来那度胺对肿瘤组织中PD1、PD-L1蛋白表达的影响 高剂量组、低剂量组PD1和PD-L1蛋白表达水平均低于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；高剂量组PD1和PD-L1蛋白表达水平均低于低剂量组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2和表4。

图2 肿瘤组织中PD-1/PL-L1蛋白表达的电泳图

表4 来那度胺对肿瘤组织中PD1、PD-L1蛋白表达水平的影响

3 讨论

肿瘤的发生、发展及预后和人体自身的免疫是息息相关的，而机体的抗肿瘤免疫主要依靠自身的T淋巴细胞所介导的细胞免疫[4]。成熟的T淋巴细胞一般分为CD4+和CD8+亚群，而缺乏CD4+和CD8+细胞可以直接导致机体免疫低下，促进肿瘤的发展[5]。树突状细胞是目前人体内功能最强的专职抗原呈递细胞，研究发现肿瘤患者存在树突状细胞缺乏的免疫缺陷[6-7]。因此，淋巴细胞亚群的变化和树突状细胞的变化可以直接反映出机体的免疫功能。人体也存在免疫抑制功能，目前公认的PD1和PD-L1在肿瘤细胞的淋巴细胞的相互结合中发挥重要的免疫抑制作用[8-9]。PD1是CD28超家族成员，表达在淋巴细胞的表面，且广泛存在于各种T淋巴细胞、B淋巴细胞，而PD1的主要功能是调节效应淋巴细胞的活化[10]。PD1的配体主要是PD-L1和PD-L2，在肿瘤研究中发现PD-L1和PD1结合后可以诱导细胞毒性T细胞的凋亡，介导肿瘤细胞的免疫逃逸和转移，而PD-L1在多数肿瘤组织中呈现高表达状态，这证明PD1和PD-L1在肿瘤的免疫抑制中发挥着重要作用[11-12]。

来那度胺是一种新型的免疫调节制剂。以往研究发现，在免疫调节方面，它可以通过激活T淋巴细胞产生IL-2、同时提高NK细胞的比例并增强其功能。在非免疫调节方面，来那度胺可以抑制IL-6表达，通过Caspase-8的表达介导细胞凋亡，还可以降低细胞色素C的释放、抵抗肿瘤血管的生成[13-14]。本研究发现，来那度胺对Lewis肺癌细胞株并无细胞毒性，不同剂量及延长作用时间并未有显著作用，提示来那度胺对肿瘤细胞不具有直接的杀伤作用。本研究发现，来那度胺不仅可以提高肿瘤组织和外周血中CD4+、CD8+比例，增强T淋巴细胞的杀伤作用，还可以提高树突状细胞比例，且高剂量效果优于低剂量，说明来那度胺对淋巴细胞的增殖和功能的增强有着很好的调节作用。在树突状细胞的表达中同样显示了来那度胺的免疫增强作用，外周血和肿瘤组织中淋巴细胞亚群变化呈现高度一致性，说明来那度胺不仅提高了肿瘤组织的免疫功能，还提高了机体整体的免疫功能。本研究发现Lewis荷瘤小鼠肿瘤组织中PD1和PD-L1蛋白水平呈高表达，这说明免疫抑制水平较高。来那度胺干预后可以显著降低肿瘤组织中PD1和PD-L1蛋白表达水平，从实验结果看，低剂量下就有很好的抑制效果，这种表达下降说明来那度胺可能对PD1/PD-L1信号有一定的干预作用，同时肿瘤重量明显减轻，推测是由于来那度胺抑制PD1/PD-L1信号后提高了免疫杀伤作用。本研究发现来那度胺对实体瘤有一定的干预作用，机制可能与机体免疫功能的增强和免疫抑制信号的拮抗有关，在双重作用下起到了抗实体瘤的作用。

综上所述，来那度胺对肺癌实体瘤的作用不是通过细胞毒性，而是通过增强免疫功能，其机制可能与T淋巴细胞亚群、树突状细胞的调节及PD1/PD-L1的表达有关。