基于生物信息学方法分析甲酰肽受体1在胶质瘤中的表达及临床意义

董 强，解琪琪，胡建宏，王茂林，袁国强，潘亚文，，*

（1. 兰 州大学第二医院神经外科，甘肃 兰州730030；2. 兰州大学第二医院骨科，甘肃 兰州730030；3. 兰州大学第二医院神经病学研究所，甘肃 兰州 730030）

胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，发病率占颅内肿瘤的46%，大约占人类恶性肿瘤的1%~3%[1]。目前，胶质瘤的治疗主要以手术，以及结合手术后放化疗为主[2-3]。虽然综合治疗的方式延缓了肿瘤的复发和延长了患者的生存期，但是患者预后仍较差。胶质瘤5年生存率小于30%，胶质母细胞瘤中位生存期只有12~15个月[4]。当前，对胶质瘤前期诊断只能依靠影像学的方法，缺乏有效的肿瘤标记物进行早期诊断和预后监测[5]。所以，寻找有效的胶质瘤分子标记物，对胶质瘤患者进行早期生存期预测和指导临床治疗有着重要意义。

甲酰肽受体1(formyl peptide receptor 1，FPR1)基因位于染色体19q13.3上，其蛋白产物是一种G蛋白偶联受体，属于FPR家族蛋白(包括FPR1、FPR2/FPRL1和FPR3/FPRL2)。据报道，FPR1结合含N-甲酰甲硫氨酸的寡肽而被激活，激活的FPR1可以介导白细胞和吞噬细胞杀死病原微生物，在先天性免疫反应中具有重要作用[6]。FPR1/nox1依赖的氧化还原信号通路参与促进肠道黏膜创伤修复[7]。大量研究显示，FPR1在多种癌症中异常表达，在肿瘤的形成和发展中起着重要作用，如胃癌、乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤和胶质瘤等[8-12]。

本研究通过下载GEO数据库中原始数据，利用R语言对胶质瘤基因芯片表达谱数据进行差异基因筛选，通过DAVID数据库对差异表达的基因进行基因本体论(gene ontology consortium，GO)功能富集，京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路分析。STRING数据库及Cytoscape软件进行蛋白相互作用网络(PPI)可视化分析筛选网络调控的关键基因。再结合Oncomine及GEPIA数据库分析FPR1在胶质瘤组织中的表达及预后情况，为胶质瘤分子机制的进一步研究提供线索和思路。

1 资料与方法

1.1 资料来源

通过NCBI的GEO数据库中下载胶质瘤患者的基因表达谱数据集GSE15824。在GSE15824数据集中我们选取30例不同级别的胶质瘤组织样本和5例正常组织样本进行分析。

1.2 方法

1.2.1 数据处理及差异基因筛选 利用R语言(3.3.0；https://www.r-project.org)“affty”包对GSE15824数据集中每个样本探针表达值进行背景校正标准化处理。通过“limmar”包对胶质瘤组织和正常组织中每个探针进行t检验和贝叶斯检验，以log2(Fold change)的绝对值>2.0和调整的P<0.01为筛选标准定义差异表达探针。最后通过GPL570 平台将探针转换成基因名称。

1.2.2 GO和KEGG分析 DAVID(the database for annotation，visualization and integrated discovery)是一个生物信息数据库，提供系统综合的生物功能注释信息[13]。为了分析差异表达基因的生物学功能和富集的信号通路，使用DAVID数据库进行GO和KEGG分析，利用R语言“ggplot2”包进行GO和KEGG可视化分析。

1.2.3 构建蛋白互作网络 STRING数据库(https://string-db.org)是一种预测蛋白之间相互作用的系统，包括蛋白之间间接相互作用的相关性[14]。将差异基因导入STRING数据库，输出蛋白相互作用的网络文件，通过Cytoscape软件进行可视化蛋白互作网络分析。利用cytoscapehubba插件把网络调控中心的基因定义为关键基因(hub gene)。

1.2.4 利用Oncomine和GEPIA数据库分析FPR1在胶质瘤中的表达及预后 Oncomine数据库是癌症基因芯片数据库和整合数据挖掘平台，旨在挖掘癌症基因信息，可用于比较癌症和正常组织的差异表达分析[15]。基因表达谱数据动态分析(gene expression profilling interactive analysis，GEPIA)是由北京大学研发的用于肿瘤与正常组织差异基因分析的在线分析工具。可以进行差异基因与临床病理分级、分期及生存期的相关性分析。利用Oncomine 和GEPIA数据库验证FPR1在胶质瘤中的表达情况。利用Kaplan-Meier方法进行FPR1与胶质瘤患者生存期的相关性分析。

2 结 果

2.1 差异表达基因

根据GEO数据库正常组织与胶质瘤组织的mRNAs矩阵数据，以log2(Fold change)的绝对值>2.0和P<0.01为筛选标准，总共有648个差异表达的mRNAs，其中包括471个表达上调mRNAs，177个表达下调mRNAs(图1A)，上调和下调最显著的前10个基因如表1。我们选取表达差异较明显的82个mRNA[log2(Fold change)绝对值>3.0] 进行聚类热图分析(图1C)。同时，我们把不同级别的胶质瘤分别与正常脑组织比较，差异基因取交集，发现总共有274个不同级别胶质瘤共同的差异基因(图1B)。

2.2 GO和KEGG分析

通过对差异表达基因GO和KEGG分析显示，这些差异基因富集的生物学过程主要包括T细胞的激活、调节白细胞的黏附、调节细胞的吞噬、细胞的迁移和甘油三酯的代谢有关(图2A)。KEGG通路分析显示，主要富集的通路包括PI3K−Akt信号通路，MAPK信号通路和钙离子信号通路以及细胞衰老、自噬和调节肌动蛋白细胞骨架(图2B)。这些信号通路都跟肿瘤的发生进程相关。

2.3 PPI分析和hub基因

图1 胶质瘤组织与正常组织中差异表达的基因

表1 胶质瘤组织与正常组织中差异表达基因中上调和下调最显著的前10个基因

为了进一步了解胶质瘤和正常组织中差异基因的蛋白调控关系，寻找蛋白调控的关键基因，我们构建了蛋白调控的互作网络图。通过在线分析工具STRING网站，根据interaction score>0.7为阈值，分析得到648个蛋白互作网络节点，然而在Cytoscape软件上进行蛋白互作网络可视化分析(图3)。利用cytoscapehubba插件定义前10个关键基因(GNG4、LPAR5、AGT、ADCY8、ADCY2、FPR1、C3、CCR1、 CXCL16、APLNR)进行进一步分析，我们发现FPR1和胶质瘤患者的生存预后相关。

2.4 FPR1的表达水平与胶质瘤患者的预后

图2 差异表达基因的GO生物学功能和KEGG信号通路富集

图3 蛋白互作网络和hub基因

利用GEPIA数据库对每个关键基因Kaplan-Meier曲线进行分析。我们发现FPR1表达水平跟胶质瘤患者预后相关，FPR1在胶质瘤高表达总体生存率低于低表达患者(|HR|=2.8，P<0.01)(图4A)。同时，通过对Oncomine 数据库数据进行非配对t检验分析发现，FPR1在胶质瘤高表达(P=1.71×10-6)，与基因芯片筛选的结果一致(图4B)。

3 讨 论

胶质瘤是神经系统中恶性程度最高，预后较差的原发性颅内肿瘤。由于呈侵袭性生长的特性，肿瘤与周围脑组织边界不清，手术不能完全切除肿瘤组织[16]。然而，一些患者对化疗和放疗存在抵抗，使患者预后较差[17-19]。所以，探索胶质瘤的发病机制，寻找跟胶质瘤早期诊断和预后相关的分子标志物是目前急需解决的问题。近年来，基因组学、转录组学和蛋白质组学方法成为肿瘤在分子水平进行机制研究的主要方法之一[20-22]，而基因芯片、高通量测序等现代生物技术的快速发展以及生物信息学方法的应用为我们从分子水平探索胶质瘤的发生、发展提供了很好的手段。本研究通过采用生物信息学方法比较分析了胶质瘤组织和正常组织中差异表达的基因，定义了648个差异表达的基因，然后采用DAVID在线分析工具对差异基因进行GO功能注释及KEGG通路分析，通过PPI网络进行胶质瘤的可视化分析和定义相关的关键基因。对筛选出的10个关键基因利用GEPIA数据库进行生存分析，我们发现只有FPR1表达水平跟患者预后明显相关。

图4 FPR1在正常脑组织和胶质瘤中的表达和生存曲线

在648个差异表达的基因中(包括471个表达上调，177个表达下调)，进行GO功能富集和KEGG信号通路分析显示，这些差异基因富集的生物学过程主要富集于T细胞的激活、调节白细胞的黏附、调节细胞的吞噬和细胞的迁移。细胞免疫的异常可以促进肿瘤的发生，细胞迁移能力增强促进了肿瘤细胞的侵袭[23-24]。KEGG通路主要富集于PI3K/Akt，MAPK和钙离子信号通路。之前研究显示，这些信号通路跟肿瘤的增殖，侵袭和迁移，细胞凋亡密切相关[25-26]。在胶质瘤发生发展中起着重要作用。Snapkov等[27]研究显示，FPR1在神经母细胞瘤中高表达，FPR1激动剂能够促使细胞内钙动员，并激活MAPK/Erk、PI3K/Akt和P38-MAPK信号通路，促进神经母细胞瘤的增殖。此研究发现与我们预测的结果一致。利用GEPIA数据库对筛选出的10个关键基因进行生存分析显示，只有FPR1表达水平跟患者预后明显相关，且FPR1在胶质瘤组织中明显高表达，和Oncomine数据库分析结果一致(如图4)。Logrank分析显示FPR1的表达水平可以作为潜在的胶质瘤患者的预后标志物。

近年来研究表明，FPR1在多种癌症均异常表达。FPR1在胃癌组织中比正常组织中表达量明显增加，且与患者生存期密切相关，表达量越高患者总体生存率越低[8]。 然而Prevete等[28]认为在胃癌中FPR1是一种抑癌基因，可以抑制肿瘤血管的生成，增高FPR1的表达可以明显抑制胃癌移植瘤的增长，跟之前的结果不一致。Chen等[12]研究发现，FPR1可以促进胶质母细胞瘤U87的侵袭和肿瘤血管形成，降低FPR1的表达，可以抑制裸鼠移植瘤的增长。Liu等[11]在黑色素瘤中发现，FPR1可以促进NK细胞的迁移，抑制黑色素瘤细胞的增长。

综上所述，基于生物信息学的方法，通过分析GSE15824数 据集数据，我们发现FPR1的表达水平与胶质瘤患者总体生存期明显相关，FPR1高表达的患者预后较差。FPR1可以作为潜在的预后判断分子标志物，为进一步研究胶质瘤发生发展的分子机制提供了新思路。