高血压患者CBS基因启动子低甲基化增加缺血性脑卒中的风险

许国栋,王长义,孔凡倩,李雯霞,胡景岑,应秀茹,段世伟,韩丽媛*

（1.宁波大学浙江省病理生理学技术研究重点实验室,中国浙江宁波315211;2.深圳市南山区慢性病防治院,中国广东深圳518054）

缺血性脑卒中是脑组织供血不足导致脑部缺血性损伤的一种神经系统疾病,它具有高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率的特点。脑卒中是西方国家排名第二的死亡原因,2013年全球因脑卒中死亡的人数约为640万[1]。据WHO报道,中国缺血性脑卒中的患病率在亚太地区排名最高[2],2013年发病人数约为74万,且从1990年到2013年增加了43.3%[3]。

高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteine,HHcy）是缺血性脑卒中的独立危险因素之一[4]。在我国,有75%的高血压患者伴有HHcy。此外,高血压与HHcy在缺血性脑卒中发病上具有协同作用。国外研究发现伴有HHcy的高血压患者并发脑卒中的风险是单纯高血压患者的12倍[5]。胱硫醚β合成酶（cystathionine beta-synthase,CBS）是同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）代谢过程中的关键酶[6]。代谢关键酶的编码基因发生突变是酶活性下降的重要原因。CBS活性下降可以引起血浆Hcy水平升高,甚至l成严重的HHcy[7,8]。甲基化是一种可遗传的、可逆的通过甲基化修饰来调控基因表达的过程,是表观遗传学中研究最深入的一种机制,常发生在CpG岛[9]。CpG岛是基因组中富含GC（鸟嘌呤和胞嘧啶）的DNA序列,常位于多数基因的启动子区[10]。当启动子CpG岛发生异常甲基化时,可影响下游靶基因的转录调控,导致基因表达异常,引起许多相关细胞信号通路的阻断,进而可能会导致疾病的发生。

目前,已有报道指出雌激素受体α基因[11]、miR-335基因[12]启动子高甲基化水平与缺血性脑卒中的发生相关。而且,在Ding等[13]进行的一项荟萃分析中发现,CBST833C基因多态性与脑卒中发生风险相关,其中C等位基因是脑卒中的一个独立危险因素。但是,这些研究均局限于正常人群,而在高血压人群中CBS甲基化与脑卒中的关系尚无明确报道。为此,本研究选取深圳市南山区慢性病防治所高血压管理人群为研究对象,通过甲基化特异性实时定量聚合酶链反应（quantitative methylation-specific polymerase chain reaction,qMSP）检测CBS基因启动子区域目标片段的甲基化率,分析高血压人群中CBS甲基化与脑卒中发病风险间的关联,为高血压患者脑卒中发病预防提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本次病例对照研究纳入来自深圳南山区社区服务中心高血压管理系统的243名高血压患者（设为高血压组）和132名高血压并发缺血性脑卒中患者（以下简称脑卒中患者,设为脑卒中组）。所有参与者均满足在深圳居住满6个月,且已纳入高血压管理系统管理的要求。高血压诊断标准为舒张压≥140 mmHg或/和收缩压≥90 mmHg,或自我报告有高血压服药史。脑卒中诊断首先通过问卷调查掌握患病史,对患有脑卒中的患者,邀请2名脑血管专家对其进行临床评估和神经影像学（CT或MRI）评定,主要按照内科学第7版教材的定义和诊断标准进行确定。排除标准为:1）患有继发性高血压、癌症、严重肝肾疾病者;2）妊娠者;3）服用叶酸或维生素B6或B12的患者。所有受试者自愿签署知情同意书。

1.2 研究方法

由受过训练的医生或护士对调查对象进行问卷调查、体格检查和生化指标检测。问卷内容主要包括年龄、性别、吸烟和饮酒情况、用药史等;体格检查包括调查对象的静坐血压、身高、体重、腰围（waist circumference,WC）和臀围（hip circumference,HC）;生化指标包括Hcy、尿酸（uric acid,UA）、甘油三酯（triglyceride,TG）、总胆固醇（total choles terol,TC）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）和空腹血糖（blood glucose,Glu）。

1.3 DNA甲基化水平检测

研究对象在空腹12 h后,用EDTA抗凝管抽取5 mL静脉血,置于低温采样箱后立即移送实验室,进行后续研究或保存在-80℃超低温冰箱。血液DNA的提取通过Lab-Aid 820核酸提取仪（厦门致善生物科技股份有限公司）及配套的试剂盒进行,DNA浓度和纯度测量采用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific Corporation,USA）。DNA亚硫酸盐转化r采用EZ DNA Methylation-Gold Kit甲基化试剂盒（Zymo Research Corporation,USA）,并严格按照说明书操作。CBS甲基化水平的检测采用qMSP[14]。反应体系为1.5μL亚硫酸盐转化后的DNA、0.5μL的正向引物、0.5μL的反向引物、10μL Zymo TaqTM PreMix和7.5μL DNAase/RNAase-free water,具体引物设计见表1。PCR扩增的条件为95℃预变性10 min;95℃变性解链20 s,56℃退火45 s,72℃延伸20 s,共45个循环;40℃延伸5 min,于4℃保存。待测样本的DNA序列完成PCR扩增后,采用Qsep100 DNA分析仪（BiOptic Inc.,China）进行甲基化水平检测。甲基化百分率（percent of methylated reference,PMR）被用来对甲基化率进行指标量化[14]。PMR由Ct值转化而得,计算公式为:PMR=2-（Ct样本-Ct内参）×100%[14]。

1.4 统计方法

采用SPSS 18.0软件进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。两组计量资料间的比较采用t检验,计数资料组间比较采用卡方检验。不同分位CBS甲基化率与脑卒中关系研究中,将CBS甲基化率第一分位数Q1、第二分位数Q2和第三分位数Q3相应区间分别赋值为1、2、3,采用多元二分类logistic回归分析模型校正混S因素后,分析CBS基因的甲基化水平与脑卒中的关系。同时将CBS甲基化率作为连续型变量纳入模型,计算CBS甲基化率每增加5%的OR（odds ratio）。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线来估计CBS甲基化率预测脑卒中发病的效果。

2 结果

2.1 基线资料

与高血压组相比,脑卒中组在年龄、性别、UA、TC、TG、体质指数（body mass index,BMI）、LDL、Glu、WC、HC、收缩压（systolic blood pressure,SBP）、舒张压（diastolic blood pressure,DBP）和吸烟状态等方面无统计学差异（P>0.05）。但是,两组中饮酒和服用降压药的状态差异有统计学意义（P<0.01）,而且脑卒中组的Hcy为21.13±18.56μmol/L,显著高于高血压组的16.97±12.89μmol/L（P=0.01）,相关数据见表2。

2.2 DNA甲基化组间比较

启动子区域CpG岛的甲基化对基因的表达具有重要影响,我们首先通过UCSC Genome Bioinformatics（http://genome.ucsc.edu/）查找CBS启动子区域是否存在CpG岛,结果显示CBS基因启动子目标片段位于Human GRCH37/hg9,chr21:44 497 096～44 497 188（图1）。为研究CBS启动子甲基化在高血压组与脑卒中组中是否存在差异,我们对两组中CBS基因启动子片段甲基化率进行了t检验。结果显示脑卒中组CBS甲基化率为38.05%,低于高血压组的50.61%,两组间差异有统计学意义（P<0.01,表2）。此外,CBS甲基化率在男性脑卒中患者为32.18%,低于男性高血压患者中的47.70%（P<0.01）,而在女性脑卒中患者与高血压患者中CBS甲基化率差异无统计学意义（P=0.08）,结果见图2。

2.3 DNA甲基化与脑卒中关系

为进一步研究高血压人群中CBS启动子甲基化与脑卒中的关系,我们进行了二分类logistic回归分析。结果如表3显示,在Model 1模型校正年龄、性别、BMI、Hcy、UA、TC、TG、LDL、Glu、腰围、臀围、SBP、DBP、吸烟、饮酒、抗高血压药物后,与CBS甲基化最低三分位数（Q1）相比,最高三分位数（Q3）与脑卒中的OR（95%CI）为0.26（0.14～0.47）,其中男性为0.14（0.06～0.36）,女性为0.48（0.19～1.20）,这种关联只在男性中有统计学意义。在校正Model 1后,CBS甲基化率每增加5%对脑卒中的OR（95%CI）为0.91（0.86～0.95）,其中男性为0.87（0.81～0.93）,女性为0.93（0.86～0.99）。在男性Crude和Model 1模型中,不同CBS甲基化率分位数对脑卒中的P-trend均有统计学意义。此外,在高同型半胱氨酸组和低同型半胱氨酸组中CBS甲基化率每增加5%对脑卒中的OR（95%CI）分别为 0.88（0.82～0.94）和 0.93（0.87～0.99）。

表1 qMSP引物序列Table 1 Primers used for qMSP analysis

Item Age（years）Gender（M/W）Hcy（μmol/L）UA（μmol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）BMI（kg/m2）LDL（mmol/L）Glu（mmol/L）WC（cm）HC（cm）SBP（mmHg）DBP（mmHg）Smoking（No/Yes）Drin11.27 115/17 112/20 13/110 0.01-2.54-0.14 0.90 1.77-0.17 1.63 0.19-0.08 0.58-0.71-0.14 0.07 7.41 7.04 4.55 P 0.69 0.96 0.01 0.89 0.39 0.08 0.87 0.10 0.85 0.94 0.56 0.48 0.89 0.79<0.01<0.01<0.01

图1 CBS启动子区域目的片段Fig.1 The characteristics of target sequences in CBS gene promoter

2.4 ROC曲线分析

采用ROC曲线分析来评估CBS启动子甲基化率对高血压患者并发脑卒中的预测效果。ROC曲线下面积（area under the curve,AUC）的计算结果如图3所示,总人群中CBS启动子甲基化率与脑卒中的AUC为0.64,95%CI为0.58～0.70（P=0.03）,男性中CBS启动子甲基化率与脑卒中的AUC值为0.69,95%CI为0.62～0.76（P<0.01）,女性CBS启动子甲基化率与脑卒中的AUC值为0.58,95%CI为 0.49～0.67（P=0.10）。

表3 CBS启动子甲基化水平与脑卒中关联的多因素logistic回归分析Table 3 Multivariable logistic regression analysis of association between CBS methylation and the risk of stroke

图3 高血压患者中CBS甲基化与脑卒中的ROC曲线Fig.3 The ROC curve of CBS methylation and stroke in hypertensive patients

3 讨论

启动子区域DNA甲基化调控是基因表达转录水平调控的重要方式之一,高甲基化会抑制基因的表达,低甲基化会促进基因表达[9]。相关研究发现CBS启动子区域高甲基化与一些肿瘤的发生发展相关。甄Ⅰ洁等[15]在研究哈萨克族CBS甲基化水平与食管癌相关的研究中发现,食管癌患者CBS甲基化率高于非食管癌患者。涂小煌等[16]发现CBS基因启动子区域高甲基化组人群中CBSmRNA水平低于低甲基化组,且在结直肠癌患者中CBS基因启动子区甲基化水平显著高于正常对照组。CBS是Hcy代谢过程中的一个关键酶,在维生素B6的催化下,能使Hcy与丝氨酸缩合成胱硫酸[17],而CBS酶的缺失,会导致Hcy在体内的聚积。本研究选取单纯高血压患者和高血压并发脑卒中患者,以探讨高血压患者中CBS启动子区域甲基化水平与脑卒中之间的关联。在对比了高血压患者和高血压并发脑卒中患者Hcy和CBS甲基化率水平后发现,脑卒中组CBS甲基化水平显著低于高血压组,但Hcy水平在脑卒中组要高于高血压组。降文兰等[17]的研究发现CBS相对表达量在正常对照组中高于脑卒中组,脑卒中组CBS基因应该处于高甲基化状态,与本研究结果不一致。可能原因是本研究的对照人群是高血压患者,高血压CBS基因表达水平高于正常人群。此外,Hcy浓度也会对甲基化水平产生影响。Cacciapuoti[18]研究发现Hcy浓度与基因组DNA甲基化程度呈负相关,Hcy可通过影响基因启动子区甲基化水平发挥生物学作用,进而影响疾病的发生发展。高浓度Hcy可通过抑制S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosine homocysteine,SAH）的代谢,来促进甲基转移酶的活性,进而导致相关基因甲基化程度降低[19]。

此外,本研究发现DNA甲基化修饰在性别上存在差异,两组甲基化率只有在男性中才存在差异,且CBS甲基化与脑卒中关联只在男性中有统计学意义。这种性别差异在相关研究中也有报道。Lin等[20]发现LINE-1基因的高甲基化增加男性缺血性脑卒中患病的风险。早期研究也发现,在C57BL/6J雄性小鼠中CBS酶的表达高于雌性小鼠[21]。我们推测这种性别差异的甲基化修饰现象可能与雄激素相关,有研究证明在雌性老鼠中注射雄激素会两倍激活肾脏中CBS酶的表达[22]。然而这种性别差异的具体机制尚不明确,需要进一步的研究来证实我们的结论。

需要指出的是,本研究的基线资料显示,高血压组和脑卒中组在饮酒和服用降压药状态上存在差异,其中高血压组饮酒率和服用降压药率均显著高于脑卒中组。根据本课题组之前针对高血压患者同型半胱氨酸流行状况及影响因素分析的研究[23],在调整年龄、性别因素后,服用降血压药组的同型半胱氨酸水平为13.66 mmol/L,与未服用降血压药组的13.23 mmol/L无统计学差异;饮酒组的同型半胱氨酸水平为13.67 mmol/L,与未饮酒组的13.54 mmol/L之间的差异也无统计学意义。本研究高血压组和脑卒中组所选人群在年龄、性别上是匹配的,故我们可以认为在本研究的人群中服用高血压药物和饮酒对于同型半胱氨酸水平无影响。而且,我们在后续研究CBS基因启动子甲基化与脑卒中关系时也均校正了饮酒、服用降压药等相关因素。

综上所述,男性高血压患者中CBS基因启动子区域低甲基化与脑卒中的发生、发展密切相关,可以作为一个有效的脑卒中早期诊断分子标志物。