正交实验优选沟眶象甲壳素的超声波提取工艺

张建英,贾 龙,张 化

（宁夏大学a.生命科学学院;b.农学院,中国宁夏银川750021）

沟眶象Eucryptorrhynchus chinensis（Olivier）属鞘翅目、象甲科。2003年从外省引入绿化苗木导致沟眶象传入宁夏中卫市和中宁县[1]。沟眶象蛀食树木根部、树皮和木质部,导致灰白色的胶体和虫粪木屑从树干或树枝流出,虫害发生不严重时引起树干受害部位流胶及树皮脱落,但是发生严重时可l成树势降低以致死亡[2]。沟眶象发生广、虫口密度大,给臭椿带来了致命的危害[2]。但沟眶象虫体富含营养物质,可以作为动物资源加以利用。本研究以沟眶象成虫为原料提取甲壳素,化害为℃,为沟眶象的防治和利用提供了新思路。目前,尚未见有关从沟眶象中提取甲壳素的研究报道。

甲壳素（chitin）又称甲壳质、几丁质,化学名为β-（1,4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖,白色固体,溶于强酸,不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂,是地球上第二大再生资源[3]。它广泛存在于甲壳类动物、软体动物的骨骼和壳、昆虫的外壳以及真菌的细胞壁中[4]。目前,酸碱法[5]、生物法[6]、乙二胺四乙酸法[7]为制备甲壳素的主要工艺,3种方法均有各自的优缺点,如:酸碱法和乙二胺四乙酸法产生的酸碱废水会污染环境,且生产周期较长[8];生物法包含酶法和发酵法,这种方法虽然对环境污染较小,但制备所用的酶价格昂贵,生产成本高,生产周期亦长。

随着超声波技术研究的逐步深入,该技术已经被应用到许多领域和生产部门[9]。超声波技术通过控制超声功率,利用超声波的3种效应,使生物细胞壁及整个生物体瞬间破裂,加快细胞内物质向外释放、扩散及溶解,从而大大提高了天然物质的提取效率[8]。在提取天然产物方面,超声波技术具有可强化传质,减少提取时间、能源及废物的产生,降低费用的同时又符合环保的要求等优点[10]。总之,超声波技术在提取天然物质方面具有十分重要的意义。

本研究用柠檬酸脱除无机盐,用氢氧化钠脱除蛋白质,探讨在超声波辅助下提取害虫沟眶象甲壳素的工艺条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

沟眶象E.chinensis成虫采自宁夏中卫市沙坡头区滨河镇袁桥村,人工在臭椿树下捕捉。采集时间为5月-9月盛发期。

1.2 仪器与试剂

数控超声波清洗器（KQ-250DE型,昆山市超声仪器有限公司）;电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9123C,杭州蓝天化验仪器厂）;紫外可见分光光度计（TU-1810,北京普析通用仪器有限责任公司）;电子分析天平[AL204,梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司];马弗炉（sx4-10,深圳市中达电炉厂）;低速台式离心机（KA-1000,上海安亭科学仪器厂）;pH计[320A,梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司];电热恒温水浴锅（二列六孔,北京长源实验设备厂）。柠檬酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）均源自西安富力化学厂。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

干燥沟眶象⇒粉碎⇒脱蛋白质⇒干燥⇒脱无机盐⇒干燥⇒脱色⇒甲壳素样品

1.3.2 指标测定

残留蛋白质含量的测定采用紫外吸收法[11],残留无机盐含量的测定采用干法灰化法[12]。文中以残留蛋白质含量为指标来衡量氢氧化钠脱除蛋白质的效果;以灰分含量为指标来衡量柠檬酸脱除无机盐的效果,最后在正交实验所得的最佳工艺条件下提取沟眶象甲壳素并利用显色反应[13]进行定性分析,计算其得率。

1.4 柠檬酸脱除无机盐的单因素实验

用柠檬酸进行脱钙处理,分别以超声时间、超声功率、柠檬酸质量浓度、固液比为因素,以经柠檬酸处理后的沟眶象干粉中灰分含量为指标进行单因素实验。

1.4.1 柠檬酸酸浸浓度的确定

准确称取5份沟眶象粉0.500 0 g,置于5个锥形瓶中,在室温条件下,以固液比1∶11分别加入不同质量浓度（0.6 g L、1.0 g/L、1.4 g/L、1.8 g/L、2.2 g/L）的柠檬酸溶液,在超声波清洗器中以超声功率为80%反应25 min,3 000 r/min离心15 min后将固体产物水洗至中性,烘干后得到脱除无机盐的沟眶象粉,测定其灰分含量从而确定柠檬酸酸浸的最佳浓度。实验重复3次。

1.4.2 超声时间的确定

准确称取5份沟眶象粉0.500 0 g,置于5个锥形瓶中,在室温条件下,以固液比1∶11加入质量浓度为1.4 g/L的柠檬酸溶液,选取超声功率80%,恒温下分别提取 15 min、20 min、25 min、30 min、35 min,3 000 r/min离心15 min后将固体产物水洗至中性,烘干后得脱除无机盐沟眶象粉,测定其灰分含量以确定柠檬酸酸浸的最佳超声时间。实验重复3次。

1.4.3 柠檬酸酸浸固液比的确定

准确称取5份沟眶象粉0.500 0 g,置于5个锥形瓶中,在室温条件下,分别以 1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15固液比加入质量浓度为1.4 g/L的柠檬酸溶液,80%超声功率反应25 min,3 000 r/min离心15 min后将固体产物水洗至中性,烘干后得脱除无机盐沟眶象粉,测定其灰分含量以确定柠檬酸酸浸的最佳固液比。实验重复3次。

1.4.4 超声功率的确定

准确称取5份沟眶象粉0.500 0 g,置于5个锥形瓶中,室温条件下,以固液比1∶11加入质量浓度为1.4 g/L的柠檬酸溶液,分别选取超声功率60%、70%、80%、90%、100%反应25 min,3 000 r/min离心15 min后将固体产物水洗至中性,得脱除无机盐沟眶象粉,测定其灰分含量以确定柠檬酸酸浸的最佳超声功率。实验重复3次。

1.5 氢氧化钠脱除蛋白质的单因素实验

用氢氧化钠进行脱蛋白质处理,分别以超声时间、超声功率、温度、氢氧化钠质量分数、固液比为因素,以经氢氧化纳处理后的沟眶象干粉中残余蛋白质含量为指标进行单因素实验。

1.5.1 氢氧化钠碱浸浓度的确定

准确称取5份沟眶象粉0.500 0 g,置于5个锥形瓶中,分别加入质量分数为4%、6%、8%、10%、12%的氢氧化钠溶液,固液比1∶16,超声功率60%,恒温60℃,于超声波清洗器中反应30 min,3 000 r/min离心15 min后将固体产物水洗至中性,烘干后得脱除蛋白质的沟眶象粉,测定其残余蛋白质含量。实验重复3次。

1.5.2 超声时间的确定

准确称取5份沟眶象粉0.500 0 g,置于5个锥形瓶中,以固液比1∶16、氢氧化钠溶液质量分数8%、超声波清洗器水浴温度60℃、超声功率60%,分别恒温反应 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min,3 000 r/min离心15 min后将固体产物水洗至中性,烘干后得脱除蛋白质的沟眶象粉,测定其残余蛋白质含量。实验重复3次。

1.5.3 氢氧化钠碱浸温度的确定

准确称取5份沟眶象粉0.500 0 g,置于5个锥形瓶中,以固液比1∶16、氢氧化钠溶液质量分数8%、超声功率60%,分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃超声波清洗器中恒温30 min,3 000 r/min离心15 min后将固体产物水洗至中性,烘干后得脱除蛋白质的沟眶象粉,测定其残余蛋白质含量。实验重复3次。

1.5.4 氢氧化钠碱浸固液比的确定

准确称取5份沟眶象粉0.500 0 g,置于5个锥形瓶中,分别以固液比 1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20加入质量分数8%的氢氧化钠溶液,超声功率60%,置于60℃超声波清洗器中恒温30 min,3 000 r/min离心15 min后将固体产物水洗至中性,烘干后得脱除蛋白质的沟眶象粉,测定其残余蛋白质含量。实验重复3次。

1.5.5 超声功率的确定

称取5份沟眶象粉0.500 0 g,分别置于锥形瓶中,以固液比1∶16加入质量分数为8%的氢氧化钠溶液,置于60℃超声波清洗器中分别以超声功率40%、50%、60%、70%、80%恒温30 min,3 000 r/min离心15 min后将固体产物水洗至中性,烘干后得脱除蛋白质的沟眶象粉,测定其残余蛋白质含量。实验重复3次。

1.6 正交实验

1.6.1 柠檬酸脱除无机盐的正交实验设计

在室温条件下,固定超声功率为100%,选择柠檬酸质量浓度、超声时间、固液比3个因素为考察对象,在单因素实验得到的3个因素最适值两端再各取一个水平,采用三因素三水平正交设计L9（33）[5]对工艺条件进行优化,因素及水平设置见表1。实验重复2次。

1.6.2 氢氧化钠脱除蛋白质的正交实验设计

固定超声功率为60%,选择氢氧化钠质量分数、碱浸时间、碱浸温度、固液比4个因素为考察对象,在单因素实验得到的4个因素最适值两端再各取一个水平,采用四因素三水平正交设计L9（34）[5]对工艺条件进行优化,因素及水平设置见表2。实验重复2次。

1.7 甲壳素样品的制备及定性和定量分析方法

1.7.1 甲壳素样品的制备

在最佳实验条件下,即以固液比1∶16加入质量分数为9%的氢氧化钠溶液,60%超声功率下65℃提取50 min,得到脱除蛋白质的沟眶象粉末;随后将脱除蛋白质的沟眶象粉末置于室温,以固液比1∶12加入质量浓度为1.8 g/L的柠檬酸溶液,100%超声功率下反应25 min后干o得到脱除蛋白质和无机盐的沟眶象甲壳素样品。按照文献报道的甲壳素最佳脱色条件,即用质量分数为15%的脱色剂H2O2在45℃下按固液比1∶15脱色[13],得到白色的沟眶象甲壳素产品。

表1 柠檬酸脱除无机盐的正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for demineralization with citric acid

表2 氢氧化钠脱除蛋白质的正交实验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test for deproteinization with NaOH

1.7.2 甲壳素定性分析方法

将提取后的甲壳素倒入培养皿中,用镊子将其依次移入95%、70%、50%、30%的乙醇溶液中清洗,再用蒸馏水冲洗待用。将甲壳素置于白瓷点滴试验板上,加入1滴0.03%碘-碘化钾溶液,再加1滴1%H2SO4,显示紫褐色,再加数滴75%H2SO4,紫色逐渐消失,表明测定物为甲壳素[14]。

1.7.3 甲壳素定量分析方法

将沟眶象干粉称重后进行脱除蛋白质和无机盐处理,烘干后得沟眶象甲壳素粉末。参照文献报道方法进行定量分析,即甲壳素得率=（提取甲壳素的干重/昆虫样品干重）×100%[5]。实验重复3次。

1.8 数据处理

采用Office 2010软件对数据进行整理,数据表现形式为平均值±标准误（）,用Excel软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）并做差异显著性检验（P＜0.05）。正交实验结果采用极差分析方法。

2 结果

2.1 柠檬酸脱除无机盐的单因素实验结果

2.1.1 柠檬酸酸浸浓度对脱除无机盐的影响

由图1A可知,随着柠檬酸质量浓度的增加,灰分含量降低,无机盐的脱除效果显著。当柠檬酸质量浓度高于1.8 g/L后,灰分含量减少相对较小并趋于平缓。从生产成本和保护环境方面考虑,选用1.8 g/L柠檬酸溶液较为合适。

2.1.2 超声时间对脱除无机盐的影响

检测结果如图1B所示,随着超声时间的延长,灰分含量下降。在反应的初始阶段,即15 min至20 min时间段内,灰分含量的下降最为明显;随着时间的增加,即反应时间达到30 min后,灰分含量虽然整体也在下降,但是下降趋势不明显。由于壳中碳酸钙与甲壳素以及蛋白质结合在一起,部分碳酸钙被甲壳素紧密的胶状分子团结构所包围。随着时间的延长,超声波的空化效应作用力有所减小,柠檬酸很难完全渗透到甲壳素胶体分子里面,导致柠檬酸不能与沟眶象干粉反应完全。当达到30 min以后,脱除无机盐的反应基本达到平衡,所以时间的延长对脱除无机盐效果的影响不大。因此本实验中选择30 min为最佳超声提取时间。

2.1.3 柠檬酸酸浸固液比对脱除无机盐的影响

图1C结果表明,固液比由1∶11变至1∶13时,灰分含量下降最为明显,由1.75%降为0.73%,而当固液比由1∶13变至1∶15时,灰分含量虽仍然有所减少但幅度不明显,由0.73%降为0.69%,分析其原由可能是随着固液比的增加,柠檬酸与沟眶象干粉接触面积增加,导致无机盐溶出量增多,当固液比为1∶13时样品中无机盐含量已接近脱除彻底,反应基本达到平衡,故固液比至1∶15时,样品中无机盐含量下降甚微。从生产成本和环境考虑,选择固液比1∶13浸泡脱除无机盐即可。

2.1.4 超声功率对脱除无机盐的影响

实验结果如图1D所示,灰分含量随着超声功率增加而降低的趋势明显;当超声功率由90%变为100%时,灰分含量的下降最为显著,由1.66%降低到1.58%。这可能是随着超声功率的增加,细胞充分破裂,甲壳素胶状分子团结构被破坏,无机盐加速溶出。由此确定超声功率为100%。

2.2 氢氧化钠脱除蛋白质的单因素实验结果

2.2.1 氢氧化钠碱浸浓度对脱除蛋白质的影响

由图2A可知,氢氧化钠质量分数越高,脱除蛋白质的效果越好,当其由10%增加到12%时,残余蛋白质含量由 0.084 μg/mL 变为 0.061 μg/mL。但氢氧化钠质量分数的增加易使甲壳素脱乙酰化生成壳聚糖,同时为了生产成本和环境保护考虑,选择质量分数10%的氢氧化钠溶液浸泡即可。

图1 柠檬酸对脱除无机盐的影响（A）柠檬酸质量浓度对脱除无机盐的影响;（B）超声时间对脱除无机盐的影响;（C）固液比对脱除无机盐的影响;（D）超声功率对脱除无机盐的影响。Fig.1 Effect of citric acid on demineralization（A）Effect of citric acid concentration on demineralization;（B）Effect of reaction time on demineralization;（C）Effect of solid-liquid ratio on demineralization;（D）Effect of power of ultrasound on demineralization.

2.2.2 超声时间对脱除蛋白质的影响

实验结果如图2B所示,反应初始阶段,残余蛋白质含量下降缓慢。当超声时间从40 min延长到50 min时,蛋白质残余量急剧下降。超声时间延长导致更多的氢氧化钠溶液进入细胞,促进了蛋白质的溶出。因此,选择提取时间为50 min较为合适。

2.2.3 氢氧化钠碱浸温度对脱除蛋白质的影响

由图2C可知,提取温度在40～60℃时,蛋白质残余量迅速下降,在60℃时达到最低值0.136 μg/mL,当温度达到70℃时,蛋白质残余量上升。这可能是在40～60℃范围内,随着温度升高反应速率加快,促进了蛋白质的溶出;而温度达到70℃以上后,蛋白质分子中的氢键断裂发生物理变化并聚集沉淀,沉淀后蛋白质与氢氧化钠反应不充分,从而残余蛋白质含量增高。由于温度过高易l成蛋白质物理变性,引起反应不充分,同时考虑到超声波清洗器的最佳性能,故选取最佳提取温度为60℃。

2.2.4 氢氧化钠碱浸固液比对脱除蛋白质的影响

结果如图2D所示。随着碱溶液体积的不断增加,蛋白质残余量明显降低,当固液比超过1∶16时,蛋白质残余量显著下降。分析其原因可能如下,NaOH溶液用量增加,使沟眶象干粉与溶剂接触面积增大,并且能够增大固液浓度差,利于扩散速度的提高。为避免溶剂浪费和环保考虑,选择固液比1∶16最为合适。

2.2.5 超声功率对脱除蛋白质的影响

结果如图2E所示。当超声功率从40%增大到60%时,蛋白质残余量由0.191 μg/mL降低为0.091 μg/mL。超声功率增大,细胞充分破裂,加速蛋白质溶出,导致蛋白质溶出量增加。当超声功率从60%继续增大到70%时,蛋白质残余量升高,这可能是由于超声功率的进一步增大,局部溶液瞬时升温,产生的热量无法及时地散去,而溶液温度过高引发蛋白质的物理变性,形成沉淀,该沉淀与氢氧化钠不能充分反应,导致蛋白质残余量升高。由此确定超声波最适提取功率为60%。

2.3 正交实验结果

2.3.1 脱除无机盐的正交实验结果

称取9份沟眶象干粉0.500 0 g,分别置于锥形瓶中,固定超声功率为100%,按表3进行正交实验,重复2次取平均值。由正交实验极差分析的结果可得,实验指标的极差顺序为 A＞C＞B,表明在室温条件下,影响柠檬酸脱除无机盐因素的主次顺序为:酸浸浓度＞酸浸固液比＞超声时间（表3）。脱除无机盐的最佳条件为A2B1C1,即在室温条件下,柠檬酸浓度1.8 g/L,超声时间25 min,固液比1∶12。按照最佳条件A2B1C1组合进行验证试验,测得残余无机盐含量为1.463%±0.030%,说明该组合下脱除无机盐效果最好。

2.3.2 脱除蛋白质的正交实验结果

称取9份沟眶象干粉0.500 0 g,分别置于锥形瓶中,固定超声功率为60%,按表4进行正交实验,重复2次取平均值。结果见表4,由正交实验极差分析的结果可得,实验指标的极差顺序为A＞B＞C＞D,表明影响氢氧化钠脱除蛋白质因素的主次顺序为:碱浸温度＞超声时间＞碱浸固液比＞碱浸浓度。脱除蛋白质的最佳条件为A3B2C2D1,即65℃下,超声时间50 min,固液比1∶16,氢氧化钠质量分数9%。按照最佳组合A3B2C2D1进行验证试验,测得残余蛋白质含量为0.040±0.001 μg/mL,说明该组合脱除蛋白质效果最好。

2.4 甲壳素定性与定量结果

2.4.1 定性结果

沟眶象成虫干粉经氢氧化钠脱除蛋白质、柠檬酸脱除无机盐后,得到的粉末符合显色反应,表明提取物确为甲壳素。

2.4.2 定量结果

应用超声波辅助酸碱法和传统酸碱法,分别对沟眶象成虫干粉进行甲壳素提取,计算提取时间（除去干o、离心和洗涤时间）和甲壳素得率,结果见表5。由表5可知,在最佳实验条件下,超声波辅助酸碱法中甲壳素的得率为16.50%,虽然比传统酸碱法低2.69%,但是超声波辅助酸碱法提取时间比传统酸碱法减少了27.75 h,仅占传统酸碱法所用时间的4.31%。

3 讨论

在超声波辅助提取沟眶象甲壳素的过程中,首先通过单因素实验初步确定了脱除无机盐和蛋白质的最适条件,然后在此基础上通过正交实验对影响显著的各因素进行优化,确定了沟眶象甲壳素的最佳提取工艺:65℃下,氢氧化钠质量分数9%、碱浸固液比1∶16、超声时间50 min、超声功率60%;室温下,柠檬酸质量浓度1.8 g/L、酸浸固液比1∶12、超声时间25 min、超声功率100%。在此工艺条件下,提取的甲壳素样品得率为16.50%,经过定性分析确为甲壳素。

图2 氢氧化钠对脱除蛋白质的影响（A）氢氧化钠质量分数对脱除蛋白质的影响;（B）超声时间对脱除蛋白质的影响;（C）碱浸温度对脱除蛋白质的影响;（D）碱浸固液比对脱除蛋白质的影响;（E）超声功率对脱除蛋白质的影响。Fig.2 Effect of NaOH on deproteinization（A）Effect of NaOH concentration on deproteinization;（B）Effect of reaction time on deproteinization;（C）Effect of temperature on deproteinization;（D）Effect of solid-liquid ratio on deproteinization;（E）Effect of power of ultrasound on deproteinization.

表3 柠檬酸脱除无机盐的正交实验方案及实验结果分析Table 3 Orthogonal test design and result analysis of demineralization with citric acid

表4 氢氧化钠脱除蛋白质的正交实验方案及实验结果分析Table 4 Orthogonal test design and result analysis of deproteinization with NaOH

表5 两种提取沟眶象甲壳素方法的比较Table 5 Comparison of two methods for extracting chitin from Eucryptorrhynchus chinensis

在提取沟眶象甲壳素的过程中,无机盐和蛋白质是沟眶象的主要组成物质,但蛋白质含量比无机盐含量多。因此,在本研究中,先用强碱氢氧化钠脱除蛋白质和部分脂质,然后再用柠檬酸脱除无机盐,这样能减少柠檬酸的用量,节约生产成本。

与传统酸碱法相比,本研究确定的沟眶象甲壳素超声波辅助酸碱法最突出的优势是缩短了提取时间,比传统酸碱法用时少27.75 h,仅占传统酸碱法所用时间的4.31%,有效地避免了在提取过程中甲壳素发生化学变化,同时也降低生产成本,适合工业化生产,推广价值高,具有很好的应用前景。目前,提取甲壳素的原材料主要是虾、蟹及蚕蛹等,作为昆虫中种类最为庞大的甲虫动物资源,其开发利用尚没有引起研究者的足够重视。沟眶象作为一种重要的林业害虫,对林业的健康发展存在着严重威胁,对其进行有效的防治一直是研究的重点。本研究转化思路,将其作为原料提取甲壳素,实现变害为宝,有利于绿色发展。