QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中105种农药残留

2018-12-06邓慧芬张建莹钟恬恬林丽敏

色谱 2018年12期

邓慧芬, 张建莹, 黄科, 钟恬恬, 林丽敏

(深圳海关食品检验检疫技术中心, 广东深圳 518045)

农药残留涉及食品、环境、贸易和日常生活安全等多方面,随着农药残留监测工作的深入开展,有关农药残留安全性的报道逐渐增多,农药的超量、滥用等不规范使用所带来的环境污染和农产品农药残留超标问题越来越受到各国政府和公众的广泛关注。在食品安全日益受到关注的同时,寻求一种简便快速、准确高效、价格低廉的多农残分析方法,将更能满足食品安全检测的需要。

目前,蔬菜中农药残留的检测方法有分光光度法[1]、酶联免疫测定法[2,3]、生物传感器测定法[4,5]、气相色谱法(GC)[6,7]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[8,9]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[10-12]、液相色谱法(LC)[13-15]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[16-19]等。分光光度法灵敏度和选择性不够好;而免疫测定和生物传感器测定法虽测定快速,但该方法在使用上有着很大的局限性:只能对有特异性反应的氨基甲酸酯类农药以及代谢物进行测定,不能对种类繁多的农药残留进行测定。气相色谱法或液相色谱法易受杂质干扰,且在检测器的灵敏度及确证检测技术上存在不足。而LC与MS联用的方法,操作简便,检出限低,定性能力好,能对复杂食品基质中农药多残留进行很好的分析。QuEChERS方法步骤少,目标化合物损失少,试剂消耗少,经济环保快速高效,适合的样品基质及农药种类多,已成为多残留分析的首选方法。

本研究的主要目的是针对我国最广泛使用及常检出的农药种类,优化QuEChERS前处理方法,建立蔬菜中105种农药多残留检测的液相色谱-串联质谱定性及定量检测方法。该方法操作简便、快速,选择性好,准确度高,具有较大的实用意义。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(日本Shimadzu公司);均质仪(美国Omni公司);旋涡振荡仪(德国Heidolph公司);往复振荡仪(日本Yamato公司);高速冷冻离心机(德国Sigma公司);超纯水仪(美国Millipore公司); 0.22 μm有机滤膜。

N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、封端十八烷基键合硅胶吸附剂(EC-C18)(美国Supelco公司)。甲醇、乙腈、正己烷、甲酸、乙酸铵均为色谱纯(德国Merck公司),无水MgSO4、NaCl均为分析纯(成都市科龙化工试剂厂);水为Milli-Q超纯水。

105种农药标准品的纯度均≥95%(德国Dr. Ehrenstorfer公司)。根据标准品的溶解度选用甲醇、乙腈或丙酮等溶剂配制质量浓度为1 000 mg/L的各个农药标准储备液,再移取适量单标准储备液使用乙腈配制成10 mg/L的混合标准溶液(-30 ℃避光存放)。

1.2 实验方法

1.2.1样品处理

称取10.0 g(精确至0.01 g)蔬菜样品于50 mL具塞离心管中,加入5 mL水,再加入10 mL乙腈,在28 000 r/min下均质1 min,然后加入4.0 g无水MgSO4、1.0 g NaCl、1.0 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠,加盖迅速摇匀,振荡提取10 min, 9 500 r/min离心5 min。取上清液,待净化。

1.2.2样品净化

取5 mL上清液,移入含900 mg MgSO4、150 mg PSA、150 mg EC-C18、30 mg GCB吸附剂的15 mL具塞离心管中,摇匀后,振荡3 min,以9 500 r/min离心5 min。取上清液1 mL,经0.22 μm有机滤膜过滤后,供LC-MS/MS测定。

杨应龙，播州宣慰使杨烈之子。“穆宗隆庆五年，烈死，子应龙请袭，命姑予职。神宗万历元年，给播州新袭宣慰使杨应龙敕书”[3]1250。可见，万历元年开始，播州便正式成为杨应龙管辖区域。在其统治下，播州为何一再被勘，邢玠在被派去勘播州时招抚政策是否失当，下面便一一展开论述。

1.3 色谱条件

色谱柱:Poroshell 120 EC-C18 2.7 μm, 100 mm×2.1 mm(美国Agilent公司)。流动相A为5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸,v/v),流动相B为甲醇。梯度洗脱程序:0～0.2 min, 10%B; 0.2～1.5 min, 10%B～40%B; 1.5～8 min, 40%B～70%B; 8～10 min, 70%B～80%B; 10～13 min, 80%B～100%B; 13～15 min, 100%B; 15～15.1 min, 100%B～10%B; 15.1～18 min, 10%B。流速:0.3 mL/min。柱温40 ℃。进样量2 μL。

1.4 质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI)。扫描方式:正负离子同时扫描。离子源温度:300 ℃。雾化气流速:3.0 L/min。干燥气流速:10.0 L/min。脱溶剂管温度:200 ℃。加热模块温度:400 ℃。加热气流速:10.0 L/min。离子源电压:4.0 kV。采用分段多反应监测(MRM)模式。分辨率:0.6 amu。驻留时间:30 ms。

2 结果与讨论

2.1 目标农药的选取

农药种类繁多,目前世界上共有几千种,我国常用的农药也有几百种。随着生产的实际需要和农药工业的不断发展,农药新品种每年都在增加。本研究根据我国禁限用66种农药名单,选取了蔬菜中禁用的15种农药;在《食品中农药最大残留限量》标准(GB 2763-2016)对蔬菜制定了限量的农药中选取了90种农药项目。所选取的105种农药均为适用于LC-MS/MS分析的常检出的代表性农药。

2.2 QuEChERS前处理方法的优化

2.2.1提取溶剂的选择

图 1 PSA、C18和GCB加入量对部分农药回收率的影响

在农药多残留分析中,常用的提取溶剂有甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等,而非极性溶剂如二氯甲烷或者二氯甲烷-石油醚毒性很大,会对分析工作者的健康构成威胁。本实验考察了甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯这4种有机溶剂对样品提取效果的差异。结果表明,以甲醇作为提取溶剂时较难分层;乙酸乙酯较适用于有机磷农药的提取,对于极性较大的农药则不易提取且极性小的脂肪、油脂等易被共萃出来;丙酮提取出的杂质和色素较多;而乙腈对农药的溶解性较强,加入乙腈的样品提取效果良好,且对油脂和色素类杂质的溶解度较小,因此本试验选用乙腈作为提取试剂。在加入乙腈之前先加入一定量的水可以明显提高样品在提取剂中的浸润效果,使样品在试剂中分布更均匀。

2.2.2样品的净化与吸附剂的选择

农药多残留分析需解决的主要问题之一是去除共提取的基质干扰物对定量准确度、灵敏度及仪器污染的影响。因此,样品前处理中对基质净化方法的选择及优化是多残留检测的关键。QuEChERS方法使用分散固相萃取(dSPE)净化,固相吸附剂直接加入样品提取液以吸附干扰物。本工作分别考察了PSA、EC-C18和GCB的加入量，结果见图1。

PSA加入量的确定 PSA可吸附糖、脂肪酸、有机酸等极性干扰物。本研究以白菜为试验对象,在白菜样品中添加0.100 mg/kg的105种农药,分别考察了加入50、100、150、200 mg PSA进行前处理时农药的回收率。实验结果表明,当PSA添加量为50、100 mg时,有部分农药化合物的回收率较低;当PSA添加量为150 mg时,105种农药的回收率在77.8%～110%,符合正常回收率要求;当PSA添加量为200 mg时,有部分农药如(涕灭威、涕灭威砜)的回收率大于120%,而苄嘧磺隆和生物苄呋菊酯的回收率则偏低(分别为53.0%和70.7%);部分回收率数据见图1-PSA。

EC-C18加入量的确定 EC-C18可吸附脂肪和蜡质等非极性干扰物。比较了添加50、100、150、200 mg EC-C18进行前处理时农药的回收率。实验结果表明,当EC-C18的添加量为150 mg和200 mg时,98.1%的农药回收率达到最佳,回收率为79.8%～98.2%;3.8%的农药如喹螨醚的回收率在添加量为150 mg时(79.8%)优于添加量为200 mg时(66.7%);部分回收率数据见图1-EC-C18。

GCB加入量的确定 GCB可吸附色素、甾醇等大分子非极性干扰物。比较了添加10、20、30、40、50 mg GCB进行前处理时农药的回收率。实验结果表明,与PSA、C18相比,GCB去除色素的效果最佳,5 mL提取液经30 mg GCB净化就能有效去除色素,使样品更加澄清,从而减小对仪器的污染;但GCB也吸附具有平面结构的农药,如多菌灵、噻菌灵、氯吡脲等,导致回收率降低;当GCB添加量为40 mg时,多菌灵、噻菌灵、氯吡脲的回收率分别为77.6%、78.1%、74.2%;当GCB添加量增至50 mg以上时,其回收率明显降低,回收率不到60.0%;部分回收率数据见图1-GCB。

综上,本工作最终确定以PSA、C18、GCB三者混合作为吸附剂,其用量分别为150 mg、150 mg、30 mg,对于色素含量高颜色较深的蔬菜样品,可适量增加GCB的用量,但不超过45 mg。

2.3 LC-MS/MS条件的优化

在电喷雾离子源正负离子模式下,先对各农药目标物的单标准溶液进行全扫描,获得稳定的母离子,SIM扫描模式优化碎裂电压;再进行子离子扫描,每个目标物选取2对响应值高的特征离子对作为定量、定性离子对,进一步优化碰撞能量。优化结果见表1。

表 1 105种农药的类型、保留时间和质谱参数

表 1 (续)

* Quantitative ions.

2.4 流动相的选择

选择5 mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇、5 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈和5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)-甲醇作为流动相进行比较,发现选用5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)-甲醇作为流动相时,目标化合物的响应信号更强,离子化效果更好,因此选择5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)-甲醇作为流动相。105种农药化合物的MRM总离子流图见图2。

图 2 105种农药的MRM总离子流色谱图

2.5 线性关系和定量限

在优化的条件下进行了方法学考察。分别配制了0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 mg/L的系列基质匹配混合标准工作溶液,105种农药在0.010～0.200 mg/L范围内线性关系良好,相关系数在0.990 1～0.999 9之间,详见表2。

以MRM定量离子的色谱峰面积(y)对分析物的质量浓度(x, mg/L)建立标准曲线,同时取经检测不含待测目标农药化合物的白菜空白基质进行定量限的考察,以信噪比(S/N)≥10确定定量限(LOQ), 105种农药化合物的定量限为0.010 mg/kg,能够满足蔬菜中农药残留的测定要求。

2.6 回收率和精确度

本实验用空白白菜、韭菜、土豆样品作为验证基质,每种基质进行3个水平的加标回收实验,加标水平分别为0.010、0.050、0.100 mg/kg,每个水平进行6次平行实验,按上述优化后的方法提取、净化样品,并进行LC-MS/MS分析,外标法定量。基于基质效应,在进行回收试验时,采用匹配的空白基质提取液进行标准溶液的配制。白菜基质的回收率结果及RSD见表2。所测化合物的回收率均在68.2%～108%之间,精密度均小于11.8%,方法的回收率和精密度均符合残留分析的要求。

表 2 白菜中105种农药的线性方程、相关系数、回收率和RSD

表 2 (续)

y: peak area;x: mass concentration, mg/L.

2.7 实际样品检测及不同方法的结果比较

应用所建立的分析方法对市场采购的芥兰、菜心、彩椒、豇豆、芹菜等蔬菜样品进行检测,同时选用GB/T 20769-2008方法进行检测。分别在芥兰、菜心、彩椒、豇豆、芹菜、油麦菜、黄瓜、白菜中检出吡唑醚菌酯、烯酰吗啉、咪鲜胺、噻虫胺、氧乐果、克百威、嘧霉胺、多菌灵、噻虫嗪等农药残留,结果表明两种方法的检测结果相近,见表3。