重组含糖识别结构域的人源半乳糖凝集素-3在糖蛋白/糖肽富集中的应用

赵 洋, 张 勇, 王明超, 孟 波, 应万涛*, 钱小红*

(1. 北京工业大学生命科学与生物工程学院, 北京 100124; 2. 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所,蛋白质组学国家重点实验室, 北京蛋白质组研究中心, 国家蛋白质科学中心-北京, 北京 102206)

半乳糖凝集素是一类进化上十分保守的可溶性凝集素蛋白质。半乳糖凝集素含有一个或两个长约130个氨基酸的糖识别结构域(CRD),对β-半乳糖苷具有特异的亲和力[1,2]。迄今,已有约15种哺乳动物的半乳糖凝集素家族蛋白质被报道,根据CRD数目可被分为三大类:单一CRD的原型,两个CRD的串联重复型,以及含有一个CRD和一个胶原蛋白质样重复结构域的嵌合型[3]。其中,半乳糖凝集素-3(Gal-3)是嵌合型中的重要成员[4],普遍存在于动物体内,主要通过非经典途径分泌产生[5]。在人体内,Gal-3由位于14号染色体q21-22位点上的LGALS3基因编码产生,在N端含有一个CRD区域,能与β-半乳糖及其缀合物特异性结合[6]。据报道,人源的Gal-3能与细胞内大量的糖蛋白相互作用,参与多种生物学过程,如细胞黏附、增殖、活化、凋亡等[7-10]。

凝集素的CRD已被广泛应用于糖蛋白/糖肽的富集与识别中,但目前绝大部分商业化凝集素都是植物凝集素,例如对高甘露糖具有特异亲和力的伴刀豆凝集素、对N-乙酰葡萄糖氨和唾液酸具有特异亲和力的麦胚凝集素、对半乳糖具有特异亲和力的蓖麻凝集素等[11-15]。这些凝集素已在线虫、鼠肝、血清、尿液等复杂样本的糖蛋白质组富集分析中得到广泛应用[16,17],但至今鲜有动物凝集素应用于糖蛋白质组的富集研究。因此,本研究基于人源Gal-3的CRD序列特征,在原核表达系统中构建了含有1个或4个串联重复CRD结构域的重组Gal-3分子,并通过生化手段对其相对分子质量、纯度、生物素化和糖蛋白结合特征等进行了综合分析。随后,将重组的凝集素蛋白质固定到链霉亲和素琼脂糖小球上,形成凝集素亲和柱,应用于糖蛋白质组的富集分析研究中。

1 实验部分

1.1 实验材料和试剂

菌种:人肝癌细胞系HepG2细胞株购自美国模式培养物集存库(ATCC),本实验室保存。大肠杆菌BL21(DE3)菌株购自中国康为世纪生物科技有限公司。PET28a-gal3c(单体)、PET28a-Gal3c(四聚体)和pBirA质粒购自中国华大基因股份有限公司,由本实验室保存。

培养基:细菌培养基为LB培养基(胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化钠10 g/L, pH 7.4, 121 ℃, 30 min),低于55 ℃时加入抗生素,固体培养基加1.5%(m/m)的琼脂粉。细胞培养基为DMEM培养液(10%(v/v)胎牛血清,60 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素)。

试剂:三羟甲基甲烷、丙烯酰胺粉末、N,N-亚甲基二丙烯酰胺购自美国Bio-Rad公司;四甲基乙二胺、十二烷基磺酸钠购自美国Promega公司;镍亲和纯化凝胶(Ni-NTA-Agarose)购自中国克劳宁生物科技有限公司(北京);所用无机盐类、乙酸、乙醇、考马斯亮蓝G250、EDTA等均为国产分析纯,购自国药试剂公司;实验所用咪唑、卡那青霉素、链霉素、四环素、氯霉素等均购自中国生工生物科技有限公司(上海);消化细胞用的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(胰酶-EDTA)消化液、细胞培养用的青霉素和链霉素双抗混合溶液、无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)均购自美国Hyclone公司;胎牛血清(BSA)购自美国Gibco公司;牛胎球蛋白、去唾液酸的牛胎球蛋白、牛脱铁转铁蛋白、马心肌红蛋白、核糖核酸酶B、生物素均购于美国Sigma公司;生物素化的伴刀豆凝集素A、麦胚凝集素、小扁豆凝集素、鸡冠珊瑚树凝集素均购于德国Vector公司;辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(HRP-链霉亲和素)、二氨基联苯胺(DAB)和增强化学发光(ECL)试剂盒均购于中国康为世纪公司;蛋白胶预染的标准蛋白质、链霉亲和素琼脂糖小球和旋转柱均购于德国Thermo公司;亲水色谱(HILIC)填料购于中国博纳艾杰尔公司;Cocktail蛋白酶抑制剂购于瑞士Roche公司。

仪器:串联质谱Q-Exactive HF、二氧化碳培养箱、离心机购、Nanodrop 2000型微量紫外光度计购于德国Thermo公司;高压灭菌锅购于日本Panasonic公司;超声波破碎仪购于中国宁波新芝生物科技股份有限公司;伯乐电泳仪和电泳槽购于美国Bio-Rad公司;凝胶扫描仪购于中国惠普有限公司;超净工作台购于中国北京东联哈尔仪器制造有限公司;脱色摇床购于中国冠森生物科技有限公司;-80 ℃超低温冰箱购于日本Sanyo公司;电热恒温培养箱购于中国上海浦东荣丰科学仪器有限公司;台式恒温振荡器购于中国苏州培英实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1重组质粒构建

根据人半乳糖凝集素-3的cDNA序列(Gene bank: CR542097.1)及已知的Gal3C结构,选取了其331～753位的核苷酸序列作为Gal3C的编码序列。同时,在该序列的3′端添加了一段编码Avi-tag的核苷酸序列:GTC TGA AAC GAC ATC TTC GAG GCT CAG AAA ATC GAA TGG CAC GAA,得到全长的片段。将该片段通过EcoR1和Xho1插入pET28a载体中,获得pET28a-Gal3C表达质粒。为了获得Tetra-Gal3C,在各个编码片段之间加入柔性氨基酸标签编码序列GGC GGT GGT GGT GGT GGC,同时进行了密码子优化。DNA重组片段的合成以及质粒构建实验由华大基因完成。将质粒转化到感受态细胞之后,通过卡那霉素和氯霉素的双重抗性筛选平板选择共表达的BL21(DE3, Gal3C/BirA)和BL21(DE3, Tetra-Gal3C/BirA)菌株。

1.2.2细菌培养及目标蛋白质的诱导表达

人肝癌细胞系HepG2使用DMEM培养液培养,在37 ℃含5%(v/v)二氧化碳及95%(v/v)空气饱和湿度温箱中常规培养。细胞每24 h传代培养,48 h后用0.25%(m/m)胰酶-EDTA溶液消化收集细胞。

在50 mL离心管中加入5 mL含50 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL氯霉素的LB培养基,分别接入两种含不同质粒的菌种进行活化。置于摇床上,37 ℃ 200 r/min条件培养过夜(～12 h)。活化后的菌种分别转入含150 mL LB培养基的三角瓶中,置于摇床上37 ℃ 200 r/min条件培养约2 h,至菌溶液在600 nm波长处的吸光值(OD600)约为0.5时为止。降温至30 ℃,向三角瓶中加入0.2 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和10 μg/mL的生物素,进行目标蛋白质诱导和生物素化。37 ℃ 160 r/min条件下继续培养8 h后转入离心管中,4 ℃ 6 000 r/min条件下离心5 min,弃上清并收集菌体。用PBS缓冲液洗涤菌体后提取目标蛋白质(Gal3C和Tetra-Gal3C)。

1.2.3目标蛋白质的提取和纯化

加入20 mL预冷的结合缓冲液(25 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L pH 7.8的NaCl,含Cocktail蛋白酶抑制剂)重悬菌体,使用超声进行破菌。10 000 g下离心30 min,保留的上清即为全蛋白提取液。活化Ni-NTA-Agarose柱后,将全蛋白提取液重复过柱3次,让目标蛋白质结合到镍柱上。用40 mL的洗涤缓冲液(25 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L pH 6.0的NaCl)洗去非特异性结合的蛋白质,最后用250 mmol/L咪唑洗脱并收集目标蛋白质。

透析袋用水洗干净,用透析夹夹住底部,加入高浓度咪唑洗脱下来的目标蛋白质溶液后,用透析夹封口,置于含1 L透析液(50 mL pH 7.8的10×PBS, 400 mL水,50 mL甘油)的烧杯中,用保鲜膜封口后置于4 ℃冰箱,磁力搅拌器搅拌过夜(约12 h),得到纯化的含低浓度咪唑的目标蛋白质。

1.2.4目标蛋白质和糖蛋白肽段的确证与定量

利用Bradford方法对目标蛋白质进行定量,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳方法评估蛋白质的相对分子质量及纯度。利用Nanodrop对富集到的糖肽进行定量分析。

1.2.5凝集素免疫印迹

标准蛋白质或全蛋白提取液用SDS-PAGE分离,然后转印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。PVDF膜置于封闭液(1×Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS), 0.05%(v/v)吐温20, 5% (v/v) BSA)中,室温封闭1 h。用含有0.05%(v/v)吐温20的TBS (TBST)溶液清洗后,按1∶5 000体积比加入生物素化的Gal3C或Tetra-Gal3C或植物凝集素,4 ℃孵育过夜。用TBST清洗后,按体积比1∶5 000加入HRP-链霉亲和素,室温孵育1 h。TBST清洗后,加入DAB或ECL试剂进行显影。

1.2.6凝集素柱制备和糖蛋白富集

加200 μL的链霉亲和素琼脂糖小球到旋转柱中,用200 μL预冷的PBS平衡柱子2次。加入500 μg的Gal3C或Tetra-Gal3C, 4 ℃旋转孵育1 h固定目标蛋白质,即为凝集素亲和柱。用注射器推压收集未结合的目标蛋白质并用PBS洗涤2次。

加入标准蛋白质或全蛋白提取液(HepG2细胞用PBS和0.1%(v/v)Triton X-100重悬,使用超声破碎提取的全蛋白溶液)到该凝集素亲和柱中,4 ℃旋转孵育过夜。置于冰上自然沉淀,注射器推压收集未结合蛋白质并进行蛋白质浓度测定。用400 μL的PBS洗涤非特异性结合蛋白质。加100 μL的8 mol/L尿素溶液到该凝集素亲和柱中洗脱糖蛋白,37 ℃旋转孵育30 min。用注射器推压收集洗脱液,重复洗脱一次,洗脱液包含富集的糖蛋白。

1.2.7糖蛋白酶切

将洗脱液加入到30 kD的超滤管中,加200 μL的8 mol/L尿素溶液,14 000 g下离心10 min。加入终浓度20 mmol/L的二硫苏糖醇,在37 ℃还原反应4 h,之后加入终浓度50 mmol/L的碘乙酰胺,室温暗处反应30 min。用200 μL的50 mmol/L碳酸氢铵替换溶液。更换新的套管,按胰蛋白酶和糖蛋白质量比1∶50加入胰蛋白酶,在37 ℃旋转反应过夜,14 000 g下离心10 min,收集酶切肽段。真空冷冻干燥肽段,用0.1%(v/v)甲酸复溶后取500 ng进行质谱分析。

1.2.8质谱分析

生物质谱仪为串联质谱Q-Exactive HF。反相色谱直喷柱采用Magic C18柱(内径150 μm,柱长12 cm, C18填料直径为3 μm)。然后利用流动相A液为含有0.1%(v/v)甲酸的超纯水,B液为含有0.1%(v/v)甲酸的纯乙腈,线性梯度为6%B～32%B,流速0.6 μL/min,进行78 min的液相色谱分离,随后进Q-Exactive HF质谱检测。Q-Exactive HF质谱检测条件:碎裂模式为高能碰撞解离模式(HCD),电离方式为纳升级电喷雾电离(Nano-ESI),采用正离子模式进行扫描,电离电压采用默认设置,一级质谱离子扫描的范围为300～1 400 Da,分辨率为120 000,自动增益控制(AGC)设置为3×106,最大注入时间(IT)设置为80 ms;二级质谱Top N设置为20, AGC设置为5×104,最大IT设置为45 ms,动态排除时间设置为12 s,质量数据由XCalibur进行实时采集。

1.2.9数据处理

质谱分析获得的RAW文件使用MaxQuant软件(1.5.3.8版)进行分析。参数设置:酶切方式为Trypsin,最大漏切位点为2。固定修饰设置为Carboxyamidomethylation (C);可变修饰设置为Acetyl (Protein N-term)、Oxidation (M);其他参数均为默认值。

2 结果与讨论

2.1 重组半乳糖凝集素-3的表征

重组构建了含有CRD结构域的人源半乳糖凝集素-3,依据CRD结构域数目分别命名为Gal3C和Tetra-Gal3C。为了更好地分离纯化重组凝集素蛋白质,在两种凝集素蛋白质上均构建了两个His标签,便于使用镍柱(Ni-NTA-Agarose)分离纯化。同时,还构建了一个由15个氨基酸残基组成的Avi标签,为固定化到链霉亲和素琼脂糖小球提供专一性结合位点[18]。Gal3C含有199个氨基酸,大约为22.5 kD; Tetra-Gal3C含有639个氨基酸,大约为71.1 kD。如图1a所示,通过镍柱分离纯化后,获得了高纯度的重组半乳糖凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C,纯度大于95%。为了评估重组半乳糖凝集素与链霉亲和素的特异亲和力,选取了HRP-链霉亲和素作为抗体进行了免疫印迹分析[19]。如图1b所示,重组半乳糖凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C与HRP-链霉亲和素发生明显的相互作用,即Gal3C和Tetra-Gal3C成功发生了生物素化。

图 1 重组半乳糖凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C的SDS-PAGE和免疫印迹图

图 2 重组半乳糖凝集素结构和凝集素亲和柱富集糖蛋白/糖肽流程示意图

2.2 重组半乳糖凝集素糖蛋白/糖肽富集流程

如图2所示,Gal3C仅含有一个CRD结构域,而Tetra-Gal3C通过聚甘氨酸接头连接了4个CRD结构域。同时,Gal3C和Tetra-Gal3C均含有两个His标签和一个Avi标签,并发生生物素化修饰。当Gal3C和Tetra-Gal3C与链霉亲和素琼脂糖小球混合孵育时,由于生物素环形结构中的咪唑酮环能与链霉亲和素发生共价结合[20],致使重组凝集素特异性地固定于链霉亲和素琼脂糖小球上,制作成凝集素亲和柱,进而可应用于糖蛋白/糖肽的亲和富集。

2.3 重组半乳糖凝集素亲和富集标准糖蛋白

人源的半乳糖凝集素-3偏向于识别并结合N-糖蛋白,特别是含有N-乙酰乳糖胺修饰的糖蛋白[21]。为了验证重组凝集素是否具有相似的糖蛋白富集特性,利用6种标准蛋白质对其进行验证,包括去唾液酸的胎球蛋白A(AF)、牛血清白蛋白(BSA)、胎球蛋白A(F)、马心肌红蛋白(Mb)、核糖核酸酶B(RB)、牛转铁蛋白(T)。其中,AF、F、RB和T是N-糖蛋白,BSA和Mb是非糖蛋白。如图3a所示,6种标准蛋白质的纯度均在90%以上,但由于BSA与AF和F的分子量较为接近,最终采用了5种标准蛋白质的混合物进行糖蛋白富集分析,不包括BSA。

为了评价重组凝集素对N-糖蛋白的特异性识别和结合能力,进行了凝集素免疫印迹分析,即将生物素化的重组半乳糖凝集素-3(Gal3C和Tetra-Gal3C)作为“一抗”,与转印到PVDF膜上的标准蛋白质混合孵育,洗涤之后与HRP-链霉亲和素孵育,最后用DAB或ECL试剂盒显色。如图3b和3c所示,Gal3C和Tetra-Gal3C均能结合N-糖蛋白AF、F、RB和T,而不与非糖蛋白BSA和Mb结合,表明生物素化的重组凝集素作为“一抗”检测灵敏度高,且具有N-糖蛋白的特异性识别和结合能力。

为了评估重组凝集素亲和柱的糖蛋白富集效能,将Gal3C和Tetra-Gal3C固定到链霉亲和素琼脂糖小球上,利用形成的重组凝集素亲和柱去富集5种标准蛋白质混合物中的糖蛋白。如图3d和3e所示,5种标准蛋白(AF、F、Mb、RB和T)具有不同的相对分子质量,其混合物能够在SDS-PAGE胶上清晰地分为5个标准的蛋白质条带。经过Gal3C和Tetra-Gal3C凝集素亲和柱富集后,3种N-糖蛋白(AF、F和T)都得到了明显的富集,特别是AF糖蛋白。结果表明Gal3C和Tetra-Gal3C凝集素亲和柱对N-糖蛋白具有特异的识别和结合能力。此外,在洗涤液中也鉴定到了5种标准蛋白质的蛋白质条带(见图3d和3e),这是因为每种蛋白质的糖基化修饰程度并不相同,未发生修饰或弱结合的蛋白质都被洗涤出来。同时,进一步验证了Tetra-Gal3C凝集素亲和柱对3种N-糖蛋白的亲和性。如图3f所示,Tetra-Gal3C对3种N-糖蛋白(AF、F和T)都表现出了良好的亲和特性,特别是AF糖蛋白。综上所述,这些结果都表明重组凝集素亲和柱能特异性地结合N-糖蛋白,具有应用于糖蛋白质组富集分析的潜能。

图 3 重组半乳糖凝集素结合糖蛋白能力分析

图 4 植物凝集素的糖蛋白亲和性评估

为了评估重组Tetra-Gal3C凝集素对糖链的亲和特异性,选用了4种植物凝集素对6种标准蛋白质进行了免疫印迹分析[22,23],包括伴刀豆凝集素A(ConA)、麦胚凝集素(WGA)、小扁豆凝集素(LCA)、鸡冠珊瑚树凝集素(ECA)。据文献报道[11-13,24], ConA可特异性地与高甘露糖型糖链亲和作用,WGA可特异性地与β1-4或β1-2连接的N-乙酰葡萄糖胺及唾液酸糖链亲和作用,LCA可特异性地与高甘露糖型糖链亲和作用,ECA则特异性地与末端为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺糖链亲和作用。如图4所示,F蛋白倾向与WGA亲和作用,表明其唾液酸糖链较多;AF蛋白倾向与ECA亲和作用,表明其含有半乳糖或N-乙酰半乳糖胺糖链;RB蛋白和T蛋白能与4种植物凝集素结合,表明含有多种糖链;而BSA和Mb蛋白均不与植物凝集素结合,表明这两类蛋白都不含有糖链。综上所述,重组的人源凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C与植物凝集素ECA类似,两者都能与含有N-乙酰半乳糖胺修饰的AF蛋白发生亲和作用,并且具有较高的选择性和特异性,因此可适用于此类糖蛋白/糖肽的富集。

图 5 HILIC, Gal3C和Tetra-Gal3C材料的糖肽富集能力对比图(n=3)

图 6 重组半乳糖凝集素亲和柱在HepG2细胞全蛋白裂解液中糖蛋白富集分析的应用

为了进一步评估重组凝集素的糖蛋白/糖肽富集能力,将50 μg的AF肽段分别使用糖肽富集材料HILIC、重组凝集素材料Gal3C和Tetra-Gal3C进行富集分析。通过定量比较分析,发现凝集素材料Tetra-Gal3C能够富集到更多的AF蛋白的糖肽,约为凝集素材料Gal3C的1.5倍和HILIC材料的2倍(见图5)。这一结果表明,Tetra-Gal3C由于含有4个串联重复的CRD结构域,因而具有更高的糖肽负载量,能够结合更多的糖肽。然而,Tetra-Gal3C的4个CRD结构域排列紧密,导致富集的糖蛋白或糖肽在空间结构上存在一定的位阻排斥效应,因此富集的糖肽含量不足Gal3C的4倍。同时,也发现凝集素材料对AF蛋白的糖肽富集率均高于HILIC,表明重组凝集素材料对N-乙酰半乳糖胺糖肽具有更高的亲和性。

2.4 重组凝集素在复杂样本中糖蛋白/糖肽富集中的应用

进一步评估了重组凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C在复杂样本中富集糖蛋白/糖肽的能力。如图6a和6b所示,重组凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C从HepG2细胞全蛋白(H)中富集了大量的糖蛋白。同时,观测到大量非糖蛋白未被重组凝集素富集,表明重组凝集素具有糖蛋白亲和特异性。然后利用重组凝集素作为“一抗”进行免疫印迹分析,通过ECL和DAB显影,发现重组凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C能够明显地与大量糖蛋白结合,且两种凝集素结合的蛋白非常类似,如图6c和6d所示。其中Tetra-Gal3C对某些特异的糖蛋白表现出了更强的亲和能力,导致显影更加明显。

利用空载的链霉亲和素琼脂糖小球作为空白对照,进一步分析了重组凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C亲和柱的糖蛋白富集能力。与对照组相比,重组凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C亲和柱均从HepG2细胞全蛋白中特异性的富集到了208种UniProt数据库中已知的糖蛋白。Tetra-Gal3C对其中的106个蛋白表现出了更高亲和性,富集到的糖蛋白峰度明显大于Gal3C富集到的糖蛋白峰度(>1.5倍,见图7)。其中,SLC7A1、ABCC4和NPC1 3个蛋白的富集倍数差高达9倍。相对Tetra-Gal3C而言,仅有44个糖蛋白表现出对Gal3C更高的亲和性(<0.75倍,见图7)。通过热图对比分析150个差异富集糖蛋白的蛋白质峰度,也发现两种材料对这150个糖蛋白有特异的亲和性(见图8)。由此我们认为,Tetra-Gal3C由于具有四重串联的CRD结构域,相对于仅有一个CRD结构域的Gal3C而言,具有更高的糖链负载量,能够富集更多的糖蛋白。空间结构原因可能导致Tetra-Gal3C对少量糖蛋白的富集能力相对减弱,因此Gal3C表现出了更高的富集特性。总体说来,这一结果表明重组凝集素亲和柱具有从复杂生物样本中富集糖蛋白/糖肽的潜能,可应用于复杂样本的糖蛋白质组富集分析。

图 7 Tetra-Gal3C和Gal3C糖蛋白富集能力的对比

图 8 Tetra-Gal3C和Gal3C差异富集的糖蛋白峰强度热图

3 结论

半乳糖凝集素-3是半乳糖凝集素家族中的重要成员,具有广泛的生物学功能,参与细胞的黏附、增殖、凋亡等生物学过程[25-27]。本文聚焦于半乳糖凝集素-3的CRD结构域在糖蛋白质组富集分析中的应用。首先,利用基因重组技术构建了一组含有一个或四个串联重复CRD结构域的人源半乳糖凝集素-3: Gal3C和Tetra-Gal3C。其次,通过生化表征和标准蛋白评估,证明了重组人源半乳糖凝集素具有糖链识别和结合的特异性,尤其是对N-乙酰半乳糖胺修饰的糖蛋白/糖肽具有显著的亲和特性。最后,将其固定化到链霉亲和素琼脂糖小球制作成凝集素亲和柱,应用于复杂生物样本中的糖蛋白/糖肽富集分析,并取得了良好的富集效果。因此,证明人源重组凝集素具有富集糖蛋白/糖肽的能力,可适用于复杂生物样本的糖蛋白质组富集分析。

综上所述,本文建立了人源重组半乳糖凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C的表达和制备方法,为人源半乳糖凝集素的生物功能研究提供了可能的实验材料。同时,基于重组哺乳动物凝集素糖结合结构域,提供了一种新的糖蛋白质组富集策略,有望推进复杂生物体系糖蛋白质组的研究。