大黄与抗生素体外协同抗哈维氏弧菌研究

郭伟良, 陈永贵, 邓恒为,3, 钟志鸿, 王 菲, 王世锋, 孙 云, 陈雪芬, 周永灿

( 1.海南大学，南海海洋资源利用国家重点实验室，海南 海口 570228； 2.海南大学 海洋学院，海南省热带水生生物技术重点实验室，海南 海口 570228； 3.中山大学 生命科学学院，广东 广州 510275 )

随着水产养殖规模的不断扩大和集约化程度的不断提高，养殖环境恶化也日趋严重，病害发生越来越频繁，严重制约水产业的发展[1-3]。哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)是海水环境中常见的条件致病菌，其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等多方面因素影响[4-5]。近年来哈维氏弧菌已成为海水养殖动物的主要的病原菌之一，对海洋渔业生产造成严重的经济损失。

抗生素由于具有起效快、效果好、促生长等优点，在水产动物病害防控中得到大量的使用[6]，然而由于抗生素在使用过程中缺乏科学性指导，抗生素的使用受到极大的限制，为此人们不得不寻找水产养殖动物病害防控的绿色有效途径[7-8]。目前，免疫制剂和中草药防治最受推崇。免疫制剂效果较好，但其专一性较强，常常只是针对某种病原菌体，且会对变异后的病菌失效[9]。中草药不仅毒副作用小、还具有增加食欲、提供营养、促进生长、增强免疫力、提高抗病力和抗应激力等多重功效，具有很好的开发前景。然而中草药一般起效慢，作用力温和，对于突然爆发的流行性疾病的控制力弱[10-11]。近年来，中草药联合低剂量抗生素，共同应用于水产养殖动物病害，起到很好的效果，被认为是最有前途的水产动物病害防控手段之一[12]。为了更好地将中草药协同抗生素应用于水产动物病害防控中，对中草药与抗生素之间相互作用的研究是非常必要且迫切的。

化学计量学是化学分析的常用方法，已被广泛应用于石油化工、农业、林业和医药工业等领域。其中响应面法常用于工艺条件优化[13-14]。响应面法的最大优点是，在合理的试验设计下，能以最少的试验点数，获取最大限度的试验信息，其采用多元二次回归的方法作为函数估计的工具，研究各因素及其交互作用对工艺过程考察指标(响应值)的影响，精确的表述各因素和考察指标之间的关系。笔者在筛出体外抗哈维氏弧菌活性较好的中草药基础上，采用全组合方法初步筛选与中草药具有协同抗菌作用的抗生素，然后采用中心组合设计试验结合响应面法，分析中草药与抗生素之间对哈维氏弧菌抑制活性的影响，精确的表述中草药提取液含量、抗生素含量与抗哈维氏弧菌活性之间的关系，以确定其最佳配比，为中草药协同抗生素在水产动物病害防控中的应用提供试验依据，具有良好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 试验材料

秦皮、黄连、大黄、五倍子、艾叶、金银花、蒲公英(海南源安隆药品超市)；强力霉素、金霉素和土霉素(宁波瑞源生物科技有限公司)，链霉素和新霉素(北京拜尔迪生物技术公司)，四环素(Sigma公司)；哈维氏弧菌为本实验室分离鉴定和保存。

液体培养基：酵母粉1 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化钠30 g/L、牛肉膏3 g/L；用1 mol/L的氢氧化钠和盐酸将pH调至7.5。半固体培养基(上层培养基)：液体培养基中加入1%的琼脂粉制备而成。固体培养基(下层培养基)：液体培养基中加入2%的琼脂粉制备而成。

1.2 试验方法

1.2.1 中草药水提液样品的制备

7种中草药于80 ℃烘箱中干燥2 h，用研钵研碎，过40目筛，制成粉末样品。分别精密称取5.0 g的7种中草药粉末样品，装入250 mL具塞三角瓶中，加入50 mL水，浸润30 min，置于沸水浴中，提取2 h，8000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，制成生药质量浓度为100 mg/mL中草药水提液样品。

1.2.2 琼脂扩散法检测药物体外抗哈维氏弧菌活性[15]

将冻存管中哈维氏弧菌30 ℃水浴解冻、转移到液体培养基中，30 ℃ 150 r/min培养24 h，按1‰接种量接入新液体培养基中，30 ℃ 150 r/min培养16 h，按该条件再传一代，4000 r/min离心收集菌体，用无菌生理盐水重悬菌体并稀释使其600 nm处吸光度值为0.8(活菌密度约为2.82×108cfu/mL)。湿热灭菌后的固体培养基趁热倒入培养皿中，每个培养皿为15 mL，平放静置冷凝。按2%(体积比)接种量将制备的菌悬液接入低于50 ℃而未冷凝的半固体培养基中，然后将半固体培养基倒入冷凝的装有固体培养基的平皿中，每个平板10 mL，摇匀平放静置冷凝。用内径为5 mm打孔器在双层培养基上均匀打3个孔，在每个孔中加60 μL样品，30 ℃培养16 h，采用游标卡尺量抑菌圈直径，每个样品平行测3次，取平均抑菌圈直径作为该样品的抑菌圈直径。

标准曲线绘制：筛出的生药质量浓度为100 mg/mL中草药水提液作为母液，将母液和6种抗生素按设计质量浓度配制成6个等质量浓度梯度标准溶液，质量浓度梯度范围见表1。采用琼脂扩散法测定每个标准溶液的抑菌圈直径，以质量浓度对数为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标，绘制标准曲线。

筛选出具有体外抗哈维氏弧菌活性的中草药水提液样品。

1.2.3 全组合方法筛选与中草药水提液协同抗哈维氏弧菌的抗生素

筛出的中草药提取液，分别以一定质量浓度与抗生素进行一一复合。假设两个药物间不存在交互作用，则根据两者的标准曲线估算两者复合物的抑菌圈直径，具体估算方法如下：a和b药物标准曲线分别为①y=a1lg(C)+b1和②y=a2lg(C)+b2，而a和b药物在复合物中的质量浓度分别为C1和C2，则复合前它们的抑菌直径分别为y1和y2，即③y1=a1lg(C1)+b1和④y2=a2lg(C2)+b2，而a药物形成直径为y2的抑菌圈时其质量浓度为C3，⑤C3=10[(y2-b1)/a1]；b药物形成直径为y1的抑菌圈时质量浓度为C4，⑥C4=10[(y1-b2)/a2]，则复合物形成的抑菌圈直径应介于⑦y3=a1lg(C1+C3)+b1和⑧y4=a2lg(C1+C4)+b2之间。采用琼脂扩散法测定复合物体外抗哈维氏弧菌活性。如果测定的抑菌圈直径小于y3和y4，则a和b药物间存在拮抗效应；如果大于y3和y4，a和b药物间存在协同抗菌作用。

1.2.4 中心组合设计试验结合响应面法中草药提取液与抗生素复合比

以筛出的中草药水提液及其具有协同抗菌作用抗生素的含量作为考察因素，进行中心组合设计试验，然后以抑菌圈直径作为响应值，进行响应面分析，分析各因素对响应值的影响和各因素之间的交互作用，以寻找各因素之间的最佳复合比例。

2 结果与分析

2.1 抗哈维氏弧菌中草药筛选结果

琼脂扩散法分别测定生药质量浓度为100 mg/mL的7种中草药水提液体外抗哈维氏弧菌活性，结果显示，大黄、金银花和黄连的水提液具有明显的抑菌圈，其直径分别为(10.06±0.08)、(7.05±0.08) mm和(7.00±0.06) mm，选择体外抑菌活性最好的大黄水提液进行下一步试验。

2.2 标准曲线的绘制

大黄水提液、四环素、土霉素、强力霉素、新霉素、金霉素和链霉素的标准曲线及其参数见表1，各药物标准曲线的相关系数均高于0.9274，表明各药物质量浓度对数与其抑菌圈直径间呈较好的线性关系，可用于各药物在特定质量浓度下抑菌圈直径的预测。

2.3 全组合试验考察中草药与抗生素之间的交互作用

采用全组合试验设计方法考察大黄水提液与6种抗生素之间的交互作用，其复合方案、复合物的抑菌圈直径估算值范围和实际检测值见表2，大黄水提液与四环素、土霉素和强力霉素之间有着较强的协同抗菌作用，尤其与土霉素之间的交互作用非常显著，促进效率达到了57.42%。而这3种抗生素均同属于四环素类抗生素。大黄水提液与新霉素、金霉素和链霉素之间无显著交互作用。

表1 各药物的标准曲线方程及其参数

表2 全组合试验方案及其试验结果

2.4 中心组合设计试验结合响应面法考察中草药与抗生素复合后的交互作用

以大黄水提液、四环素、土霉素和强力霉素质量浓度为考察因素，进行四因素三水平的中心组合设计试验，其因素水平见表3，其设计方案与试验结果见表4。

以抑菌圈直径作为响应值(y)，各药物的质量浓度编码值作为变量，采用SAS RSREG程序对试验结果进行响应面分析试验，回归模型为y=15.2157+0.4258x1+0.1105x2+0.2268x3+0.4728x4-0.5484x12+0.1018x1x2-0.0080x1x3-0.1183x1x4-0.0044x22+0.2378x2x3+0.4055x2x4+0.0786x32-0.4533x3x4-0.2289x42

模型的相关系数为0.8239，说明响应值82.39%信息量是由所选变量引起的，采用F检验方法对模型进行显著性检验，其Pr>F值为0.0104，表明模型显著可靠。采用F检验方法对模型中各项系数进行显著性检验，结果见表5，在设计的质量浓度范围内，大黄水提液(x1)、土霉素(x3)和强力霉素(x4)的质量浓度对抑菌圈直径(y)影响显著，大黄水提液和强力霉素的质量浓度影响为极显著，而四环素(x2)在设计的低质量浓度范围内对抑菌圈直径(y)的影响并不显著。Pr>F(x1x2)、Pr>F(x1x3)、和Pr>F(x1x4)均大于0.1，表明低质量浓度的3种抗生素对大黄水提液的抑菌活性的促进作用并不显著，而x2x3和x2x4的系数为正，表明四环素对土霉素和强力霉素有一定促进作用，但x3x4系数为负，且Pr>F(x1x4)<0.05，表明土霉素与强力霉素之间呈显著交互抑制作用。

表3 大黄水提液与抗生素复合中心组合设计试验因素水平表

表4 中心组合设计试验方案及试验结果

表5 响应面分析结果

两两药物之间交互作用的响应曲面图见图1～图6，可以直观的观察到两两药物之间对响应值的影响，由图1可知，抑菌圈直径(y)沿着大黄水提液(x1)的坐标轴由低质量浓度至高质量浓度变化呈抛物线状，先增后降，而响应曲面与四环素(x2)坐标轴呈平行态，故在设计的质量浓度范围内，四环素的质量浓度对y基本无影响，而其等高线图呈半椭圆形，其轴线与坐标轴呈几乎平行态，故大黄水提液与四环素在考察的质量浓度范围内交互作用不显著；由图2可知，抑菌圈直径(y)沿着大黄水提液(x1)的坐标轴变化趋势与图1基本一致，而沿着土霉素(x3)坐标轴，随着土霉素质量浓度增加，抑菌圈直径(y)也在不断增加，而等高线与图1类似，故大黄水提液与土霉素在考察的质量浓度范围内交互作用也不显著；图3响应曲面所呈规律与图2相类似，大黄水提液与强力霉素在考察的质量浓度范围内交互作用也不显著；图4与图5的响应曲面都是沿着(-1，-1)至(1，1)直线剧增，至高区域在(1，1)附近，其等高线也呈半椭圆形，其轴线与(-1，-1)至(1，1)直线几乎平行，四环素(x2)与土霉素(x3)、强力霉素(x4)之间存在着交互促进作用；相反，图6响应曲面都是沿着(-1，-1)至(1，1)直线剧降，至低区域在(1，1)附近，其等高线也呈半椭圆形，其轴线与(-1，-1)至(1，1)直线几乎平行，土霉素(x3)与强力霉素(x4)之间存在着显著的交互抑制作用。

通过以上分析，表明各药物之间的关系较为复杂，采用模式搜索方法对响应模型最优化配方进行搜索，结果显示，在模型可预测范围内，大黄水提液与四环素、土霉素和强力霉素的最佳配比为45∶0.07∶0.12∶0.10，在此最佳复合方案下，模型预测其抑菌圈直径(y)为16.07 mm。

图1 y=f(x1, x2)的响应面和等高线

图2 y=f(x1, x3)的响应面和等高线

图3 y=f(x1, x4)的响应面和等高线

图4 y=f(x2, x3)的响应面和等高线

图5 y=f(x2, x4)的响应面和等高线

图6 y=f(x3, x4)的响应面和等高线

2.5 验证试验

采用响应面法对大黄与抗生素的复合方案进行优化结果，大黄水提液∶四环素∶土霉素∶强力霉素=45∶0.07∶0.12∶0.10，在此最佳复合方案下，模型预测其抑菌圈直径(y)为16.07 mm，在最佳的复合方案下进行平行3次验证试验，抑菌圈直径(y)为(15.90±0.09) mm，与预测值间相对误差为1.06%，表明该方法确实可行。

3 讨 论

文献报道[16-20]，大黄提取液有显著的体外抗哈维氏弧菌活性，其最小抑菌质量浓度为0.24～50 mg/mL，本试验采用琼脂扩散法检测7种中草药水提液体外抗哈维氏弧菌活性，试验结果显示，同为100 mg/mL质量浓度下大黄水提液抗哈维氏弧菌抑菌圈最大[(10.06±0.08) mm]，其最小抑菌质量浓度低于25 mg/mL(大黄水提液标准曲线最低质量浓度)，与上述的文献报道基本相符。中草药与抗生素联合应用，是解决中草药起效慢和对重症或急症疗效不显著、抗生素耐药机率高和药物残留等难题的有效途径之一，然而并非所有中草药和抗生素间均存在协同作用，甚至很多情况下两者之间存在明显的拮抗作用，为此中草药与抗生素配伍使用必须先考察两者间的交互作用[21]。目前常采用的方法有棋盘法、时间—杀菌曲线方法和琼脂扩散法，然而棋盘法因采用微孔板作为病原菌培养容器，培养容量小，病原菌生长受外界因素干扰大，结果准确度难以得到保障，而且仅限于考察两两药物之间的交互作用[22-23]；而时间—杀菌曲线较为费时费力[24-25]。为此本研究采用操作简便、结果可靠的琼脂扩散法考察两两药物之间的交互作用[26]，结果显示，在较高质量浓度下四环素类抗生素土霉素(0.27 mg/mL)、强力霉素(0.20 mg/mL)和四环素(0.13 mg/mL)分别对大黄水提液(生药质量浓度67 mg/mL)的体外抗哈维氏弧菌活性具有促进作用，而氨基糖苷类抗生素链霉素和新霉素对大黄水提液的抗哈维氏弧菌体外抑制活性没有显著的促进作用，张玉国[27]研究表明，25～100 mg/mL大黄水提液可使大肠杆菌(Escherichiacoli)的四环素最小抑菌质量浓度降低1～3个梯度，本试验研究结果与该结果基本吻合。采用中心组合设计试验结合响应面法考察大黄水提液、土霉素、强力霉素和四环素组合后两两药物之间的抗菌交互作用。姚远等[28]成功采用响应面法考察了乳酸钠、茶多酚与壳聚糖对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)抑制作用间的交互作用，发现三者对铜绿假单胞菌的抑菌效果由大到小为乳酸钠、壳聚糖、茶多酚；乳酸钠和茶多酚存在明显的拮抗作用；乳酸钠和壳聚糖存在明显的协同作用；而茶多酚和壳聚糖之间交互作用不显著，并获得乳酸钠和壳聚糖最佳复合配比为62.5∶3.17。而本研究结果显示土霉素(0.06～0.27 mg/mL)、四环素(0.01～0.07 mg/mL)和强力霉素(0.05～0.11 mg/mL)在低质量浓度情况下对大黄水提液(10～50 mg/mL)的抗哈维氏弧菌的体外抑制活性无显著的促进作用，这与报道的大黄提取液(2 mg/mL)与四环素(5 μg/mL)对弧菌发光抑制作用为加和作用结果[29]相符；响应面法分析表明，土霉素与强力霉素体外抗哈维氏弧菌活性时存在着显著的交互抑制作用。经过中心组合设计试验，结合响应面法优化，获得大黄、四环素、土霉素和强力霉素的最佳复合比，并根据模型给出预测值，在最佳复合方案下进行了验证试验，得出该方法确实可行的结论，在中草药和抗生素联合用药研究方面提供新的思路和方法，具有广阔的应用前景。

大黄主要抑菌成分为蒽醌类化合物，其抗菌机制主要包括通过抑制病原菌细胞线粒体呼吸电子传递；抑制菌体糖及糖代谢中间产物的氧化和脱氢过程，影响组织细胞生命活动所需能源的供应；与DNA结合，干扰其模板功能，抑制蛋白质和核酸合成；降低生物膜的稳定性，干扰能量代谢的酶促反应等[20]。四环素类抗生素通过与细菌胞内核糖体30S亚基形成可逆结合体，抑制蛋白质合成；也可通过结合线粒体70S亚基，抑制线粒体蛋白质的合成[30]。大黄与四环素作用机制和靶位不同，这可能是两者之间存在协同抗哈维氏弧菌的原因，然而两者的协同抗菌机制仍需进一步研究确定。虽然本研究结果表明，大黄水提液与四环素体外具有协同抗哈维氏弧菌作用，但两者联合应用于防治哈维氏弧菌引发的动物疾病还需结合药物动力学与药效学等多因素进行研究。