鱼类性别特异性DNA分子标记研究进展

施文瑞，王 磊，陈军平，吴利敏，李学军

( 河南师范大学 水产学院，河南 新乡 453007 )

鱼类是目前分布最广、种类最多的脊椎动物类群，已知的现存鱼类约28 000余种[1]，超过了其他脊椎动物的总和，在脊椎动物的演化过程中处于承上启下的关键地位。鱼类具有丰富多样的生物学特征和重要的经济价值，是人类获取动物蛋白的主要途径之一，对人类社会的生产生活具有重要意义。鱼类的性别分化会受到外部环境因子(如温度、光照和食物等)的影响[2]，如高温会导致尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)的遗传雌性发育为生理雄性。鱼类的生长和生殖关系密切[3]，因此了解鱼类的性别决定机制对于研究其性别控制育种至关重要[4-5]，例如半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)[6]、褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]和泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)[8]等的雌性个体比雄性个体生长快，而黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[9]和罗非鱼等的雄性个体比雌性个体生长快，因此通过调控此类鱼的性别比例可以快速改变其生长性状，在养殖中具有重要意义。

寻找性别特异分子标记是一种较简捷的进行雌雄鉴定的方法。性别特异分子标记是指鱼类某种性别基因中特有的DNA片段，是一种通常只存在于异配性别中的特异DNA标记。近些年来，科研人员用不同的分子标记技术，如RAPD、SSR、AFLP和SNP等在一些鱼类中找到了有关性别特异或性别连锁的DNA片段，为鉴定鱼类的遗传性别，定位和鉴定鱼类性染色体奠定了基础。筛选鱼类性别相关分子标记不仅能够在生长发育早期鉴定鱼类性别，而且可以鉴定伪雄鱼和伪雌鱼，这对培育具有生长优势性别的单性苗种以及鱼类的性别控制均具有重要意义。

1 DNA分子标记技术

目前对于分子标记概念的界定有广义和狭义两种，广义上的分子标记是指能够遗传并且检测的DNA序列或蛋白质，狭义的分子标记(亦是本文中所提到的分子标记)则仅指DNA标记[10]。对比常规的遗传学标记(如形态标记、细胞标记以及生化标记)，DNA分子标记具有其独特的优势[11]：(1)DNA样品的获得不受外界环境及发育阶段的影响；(2)标记数量丰富且遍布整个基因组；(3)表现为中性，不会影响目标性状的表达；(4)多态性高，自然存在的等位变异多；(5)试验所提取的DNA样品在特定条件下能够长期保存，对于试验结果的验证是非常有利的；(6)许多标记表现为共显性，能够区分纯合体和杂合体。正是由于这些优越的特性，DNA分子标记的应用十分广泛，分子标记技术也在经历了数十年的发展后，日趋成熟。不同的分子标记技术具有不同的特点，鱼类性别研究中常用的分子标记技术比较见表1。

表1 常用分子标记技术的比较

2 鱼类性别特异性DNA分子标记研究进展

2.1 鱼类性别特异RAPD标记

RAPD是由Williams等[12]于1990年利用随机合成的单个引物进行扩增进而寻找多态性DNA片段作为分子标记发展起来的一种技术，能够快速、简便地进行遗传标记和遗传多样性分析，并广泛应用于鱼类遗传多样性研究以及鱼类种质鉴定等领域[13-15]。

杨玲等[16]以奥利亚罗非鱼(O.aureus)为试验材料，获得了1个雌性特异性的RAPD标记片段(RAPD71699-1488)，并成功地将该RAPD标记片段转化为SCAR标记，在两个群体共200尾个体上(雌、雄各100尾)验证的符合度为100%，可以应用到奥利亚罗非鱼的性别遗传鉴定中；Luzio等[17]用ISSR和RAPD技术在斑马鱼(Daniorerio)的雌雄个体中测试了100个ISSR和280个RAPD引物，将得到的3个呈现性别特异的DNA片段进行克隆转化后得到序列扩增区，在斑马鱼群体中使用这些潜在标记，可以在测试群体中正确识别80%的雄性(DrSM_M)和100%的雌性(DrSM_F1tDrSM_F2)；Sun等[18]在尼罗罗非鱼(O.niloticus)中利用RAPD和AFLP技术找到4个性别连锁标记。利用RAPD技术在亚马逊石脂鲤(Bryconamazonicus)[19]、大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)[20]中也找到了性别特异DNA序列。

2.2 鱼类性别特异AFLP标记

AFLP即扩增片段长度多态性，是1993年由Zabeau等[21]基于PCR技术发明创建的一种DNA分子标记技术，广泛用于鱼类遗传图谱的构建、遗传多样性分析及标记辅助育种等[22-24]。

刘昕[25]通过AFLP技术对比分析孔雀鱼(Poeciliareticulata)雌雄基因组之间的不同，得到了1个雄性特异的AFLP标记(PreF262)，并将其转化为SCAR标记，建立了能够快速鉴定孔雀鱼遗传性别的PCR技术；闫松松等[26]用AFLP技术筛选香鱼(Plecoglossusaltivelis)的性别特异性分子标记，仅引物组合E-ATG/M-CTG扩增到1条雄性特异性条带,以该雄性特异性AFLP条带的DNA序列为模板，设计1对特异的PCR引物，并在10尾已知性别的香鱼(雌雄各5尾)中扩增检验，结果显示，5尾雄鱼均可扩增到目的条带，而5尾雌鱼均无扩增，表明该序列是雄性特异性分子标记，可用于鉴别香鱼的遗传性别，并为香鱼的性别决定机制和性别控制研究奠定基础[26]；Vos等[27-28]利用AFLP技术发现，在太平洋蓝鳍金枪鱼(Thunnusorientalis)中存在雄性特征片段及其遗传结构的DNA序列；利用AFLP在黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[29]和大颚小脂鲤(Salminusbrasiliensis)[30]中也找到了性别特异标记。

2.3 鱼类性别特异SSR标记

SSR即简单重复序列，由1～6个碱基的核心序列串联重复而成，是一类信息量丰富、重复性好、多态性高、易操作、杂合度大的共显性DNA分子遗传标记，广泛应用于鱼类遗传多样性研究、种群亲缘关系研究等领域[31-32]。

在半滑舌鳎中分离出性别连锁的SSR标记CseF-SSR1，可用于区分ZW雌性和WW超雌性[33]；岳亮等[34]采用以BSA为基础的微卫星标记技术，在红鳍东方鲀(Takifugurubripes)雌、雄基因池中扩增出8对差异条带的引物，通过验证发现，引物 f383是与其雄性呈正相关的微卫星标记；Liao等[35]在半滑舌鳎中通过筛选基因组微卫星鉴定了一个共显性性别连锁标记(即CyseSLM)；Xu等[36]用微卫星标记在条石鲷(Oplegnathusfasciatus)中得到了一个Oplfa16的雄性特异性微卫星标记。此外，在五条(Seriolaquinqueradiata)[37]、多刺鱼(Pungitiuspungitius)[38]、狭鳞庸鲽(Hippoglossusstenolepis)[39]等中均可分离出性别特异微卫星标记。

2.4 鱼类性别特异SNP分子标记

SNP作为一种新兴的DNA分子标记技术，具有广阔的应用前景[40-42]。Houston等[43]用RR-seq、RNA-seq、RAD-seq技术得到了大西洋鲑(Salmosalar)>400 K的假定SNPs, 用于大西洋鲑的高密度SNP基因分型阵列, 该阵列可以清楚地区分养殖和野生种群内部和之间不同来源的鱼，阵列上包含的Y染色体特异性探针为性别鉴定提供准确的分子遗传学检测；Palaiokostas等[45]用RAD-seq构建了尼罗罗非鱼的连锁图谱，并发现了一组与性别紧密相关的SNP标记，并用RAD-seq技术构建了第一个基于SNP的欧洲鲈鱼(Dicentrarchuslabrax)连锁图谱，其由24个连锁群上的6706个SNPs组成，与传统的基于谱系的选择相比，基于SNP的雌性欧洲鲈鱼选择效率显示出轻微的优势，此项研究结果为欧洲鲈鱼的多基因性别决定假说提供了额外的支持；王婷等[46]基于高通量转录组数据对大菱鲆(Scophthalmusmaximus)SNP标记进行筛选，获得了2个与雌、雄性状相关的SNP标记；Bradley等[47]开发了精确的斑马鱼SNP遗传图谱，并将其应用于性别决定的遗传组分研究，结果表明，斑马鱼的性别决定是一个复杂的过程，除性染色体外，还在第5号和第16号染色体上鉴定了2个在性别决定方面具有显著统计学意义的基因座。Xu等[48]在岩鲷(Oplegnathusfasciatus)中利用AFLP技术开发了3种雄性特异性SNP标记，可用于该物种的遗传性别的分子鉴定，为人工养殖鲷鱼的进步提供支撑。

2.5 基因组测序技术在鱼类性别特异标记中的研究进展

Chen等[49]对雄性(ZZ)及雌性(ZW)半滑舌鳎的整个基因组进行了测序，构建了半滑舌鳎全基因组序列图谱，这也是世界上第一个比目鱼的基因组图谱，从而为发现半滑舌鳎的染色体起源、性别决定机制以及比目鱼的底栖适应机制提供了珍贵的基因资源；Fowler等[50]为了鉴定性别特异性基因型标记，利用双酶切RAD[51]技术对姊妹种肉色平鲉(Sebastescarnatus)和黄黑平鲉(S.chrysomelas)的基因组DNA进行测序，在2个群体中均能检测到雄性特异基因座，但未检测到雌性特异基因座，这为其由XY决定性别机制提供了证据；Chen等[41]对黄颡鱼进行转录组测序，经比较分析，筛选了至少21个性别决定和分化的相关基因；Wilson等[52]利用RAD标签群体基因组学在4个斑马鱼品系中发现了1个单一的性别连锁区域；Maroso等[53]使用ⅡB型限制性内切酶的RAD[54]技术对地中海8个地区的共140尾鲯鳅(Coryphaenahippurus)进行研究，鉴定了大量SNP标记，确定了311个性别相关位点。

3 展 望

我国鱼类分布广泛，种质资源丰富，许多鱼类雌雄个体之间存在着明显的生物学差异，如个体大小、性成熟年龄和体型等，根据雌、雄鱼经济性状的差异来调控其性别比例可大幅提高相关鱼类的经济效益，因此开展这些鱼类性别相关分子标记的研究具有重要意义。截至目前，虽然鱼类性别相关分子标记的研究取得了一定的进展，但是仍存在一些问题。由于鱼类是最低等的脊椎动物，有些性别相关分子标记在同一物种不同群体之间甚至家系之间也可能存在一些差异；另外，鱼类种类较多，进化程度相差较大，有些鱼类没有进化出异质性染色体，根据其形状和大小很难区分其性染色体和常染色体，可利用荧光原位杂交技术对已发现的性别连锁的基因或标记定位，可以鉴定性染色体，从而能够实现鱼类早期的性别鉴定。高建军等[55]发现能够成功寻找到性别特异标记的鱼类通常是存在性染色体的鱼类，使用传统方法较难筛选出性别相关分子标记。在下一代测序时代，越来越多的物种以前所未有的速度积累了序列资源，RAD-seq是在高通量测序技术的基础上兴起的一项基于全基因组酶切位点的简化基因组测序技术，具有覆盖整个基因组的特点，可以更容易和更经济地开发基因组标记[51-54]及性别研究，通过RAD-seq及其衍生技术构建遗传图谱，结合QTL定位阐明其性别决定机制并开发性别标记，已成为研究鱼类性别及其性别特异标记的一个重要手段。近年来，随着测序成本的下降，简化基因组测序技术已广泛地应用于鱼类性别相关标记的筛选，相信随着测序成本的进一步下降，基因组测序技术将全面应用于鱼类性别相关标记筛选及性别调控机理研究。