黑豆中多酚类物质的提取及抗氧化活性检测

◎ 任梦瑶，汪莎莎，高 涵，于海坤，陈 玲，王冰玉，杨延存

（青岛工学院，山东 青岛 266300）

植物多酚（Plant polypheno1）是一类广泛存在于植物体内的多酚类物质[1]，在植物中的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素，主要存在于植物的皮、根、木、叶、果中。植物多酚在自然界的储量非常丰富，含多酚较多的常见植物超过600种，在某些针叶树皮中多酚含量达20%～40%，仅此，每年在全球形成了数以亿吨的可再生绿色资源。天然抗氧化剂主要来源于植物多酚[2]，而且，研究表明，植物多酚含量及种类与抗氧化性功效有关。黑大豆是我国珍稀的优异粮油作物资源，也是较理想的保健食品原料[3]，黑豆含有丰富的维生素、蛋黄素、黑色素及卵磷脂等物质[4]。为了提高对黑豆的利用，本试验拟对黑豆中的多酚类物质进行提取和检测，并进一步检测其抗氧化能力及提取条件，从而更加全面地挖掘其营养利用价值。

1 材料与方法

1.1 供试材料

黑豆，购买于胶州宝龙城市广场大润发超市。

1.2 仪器与设备

750T型多功能粉碎机（铂欧五金厂），KH5200B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）、80-2电动离心机（上海梅香仪器有限公司），722N型分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），101-3A型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），旋转蒸发器RE-52A（上海亚荣生化仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 多酚提取率的测定

分别精确量取0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL和1.50 mL没食子酸标准溶液于25 mL比色管中，再分别加入3.0 mL福林-酚试剂，摇匀静置30 s后加入6.0 mL 12%Na2CO3溶液，最后用蒸馏水定容至25 mL，室温下反应2 h，以0样为空白，在760 nm下测定其吸光度，绘制标准曲线。根据标准溶液测定结果，得出多酚提取率计算回归方程为A=82.676 C+0.002 3，R2=0.999 5，式中A为样品吸光度值，C为样品中多酚提取率。取样品多酚提取液1 mL，采用和标准曲线相同的方法测定样品中多酚含量，以没食子酸计。

1.3.2 多酚DPPH清除作用的测定[5-6]。

取提取液样品溶液4 mL于试管中，依次加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，25 ℃水浴中反应20 min，在517 nm处测定吸光度。以蒸馏水做空白。以相同浓度维生素C作对比。

式中，A1为4 mL样液+2 mL DPPH对应吸光度值；A2为4 mL样液+2 mL 95%的乙醇对应吸光度值；A3为4 mL蒸馏水+2 mL DPPH对应吸光度值。

1.3.3 单因素试验

根据对不同试剂的预试验，将黑豆以不同溶剂（30%甲醇、70%甲醇、30%乙醇、70%乙醇、蒸馏水）浸泡，在一定温度（30、40、50、60 ℃和70 ℃）下水浴，提取一定时间（1、3、5、7 h和9 h）后，检测多酚提取率。

1.3.4 正交试验

根据单因素试验结果对提取温度（A）、提取时间（B）、提取溶剂（C）进行L9（33）正交试验，以多酚提取率为评价指标，优化多酚类物质的提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂对于黑豆中多酚提取率的影响

为全面考察溶剂对于多酚提取率的影响，试验过程对甲醇溶液、乙醇溶液进行了单独试验，挑选出最佳的提取浓度，与蒸馏水一起对原料中多酚进行提取比较，分析提取溶剂对提取率的影响。由图1可知，在相同条件下，用30%甲醇提取黑豆中多酚类物质，提取率最高，其次为蒸馏水与30%乙醇。

图1 提取溶剂对于黑豆中多酚提取率的影响图

2.2 提取温度对于黑豆中多酚提取率的影响

由图2可以看出，当温度较低时，黑豆中多酚提取率较低，应该是较低温度限制了多酚的析出；当提取温度在60 ℃时，黑豆中多酚的提取率是最高的；当温度超过60 ℃时，多酚提取率有所下降，应是过高的温度导致提取物变质或被空气迅速氧化。

图2 提取温度对于黑豆中多酚提取率的影响图

2.3 提取时间对于黑豆中多酚提取率的影响

从图3可以看出，多酚提取率随提取时间的增加出现先增后减的变化趋势。黑豆中多酚提取率在3 h达到峰值。当提取时间较短时，提取率不高，是溶出时间不够造成的；时间过长，提取率降低应是多酚被缓慢氧化导致。

图3 提取时间对于黑豆中多酚提取率的影响图

2.4 黑豆中多酚提取正交试验

根据单因素试验，设计黑豆提取条件正交试验因素水平表如表1所示，结果如表2所示。

表1 黑豆提取条件正交试验因素水平表

黑豆中多酚提取正交试验结果如表2所示。通过正交试验，根据极差的大小判断各因素影响黑豆中多酚提取率的主次顺序为A＞C＞B，即黑豆多酚的提取率最主要影响因素为提取温度，其次为提取溶剂浓度、最后是提取时间。按照平均值大小选取最优水平为A2B2C2，即提取条件为温度55 ℃、提取时间为3 h、浸提溶剂及浓度为30%甲醇溶液。经过验证试验，在该条件下对黑豆中多酚进行提取，提取率达到0.198 7 mg/g，确为最优。

表2 正交试验结果表

2.5 黑豆中的多酚粗提液抗氧化能力检测

对黑豆中提取的多酚粗提液进行抗氧化能力检测。在最佳提取条件下提取，采用DPPH清除率法进行测定，结果显示清除率为12.33%。

3 结论

本研究以黑豆为原料，对其多酚类物质的提取条件及抗氧化活性进行研究。试验中对黑豆中多酚的提取条件进行单因素试验和正交试验优化提取条件，确定抗氧化能力最强时的提取条件。研究结果显示，对黑豆中多酚类物质提取率影响最显著的是提取温度，其次为提取溶剂浓度，最后是提取时间。黑豆中多酚提取率最高的提取条件为：提取温度55 ℃、提取时间为3 h、浸提溶剂及浓度为30%甲醇溶液。在最佳提取条件下获取的粗提液的DPPH清除率为12.33%。