非洲菊4个POD基因的克隆及表达分析

郝向阳，孙雪丽，刘 范，项蕾蕾，王天池，赖钟雄，程春振

(福建农林大学 园艺植物生物工程研究所，园艺学院，福州 350002)

过氧化物酶(Peroxidase，POD，EC 1.11.1.X)是一类普遍存在于动植物和微生物中的氧化酶。植物中存在Class Ⅰ和Ⅲ两类POD，其中Class Ⅲ POD(PRX，EC 1.11.1.7)为植物所特有[1-2]。PRX由一个多基因家族编码，在拟南芥中该基因家族有73个成员，而水稻有138个成员[3-5]。此类POD参与植物体内的过氧自由基和H2O2平衡的维持[6-7]，在植物生长发育过程中发挥着重要作用[8]。此外，POD还参与木质素合成[9-10]、活性氧代谢[11]、激素调控[12]及其他胁迫应答[13-16]。如：在低温和干旱胁迫下，烟草POD活性均呈现出先升高后降低的趋势[17]，说明POD参与了烟草低温和干旱胁迫的响应；李国旗等[18]的研究发现，杨树形成层POD活性除了与耐盐性有关外还与其所处的生长周期有关。

植物被病原菌侵染后，能迅速产生大量的ROS来抵御病原菌的入侵或杀死病原菌，但过量的ROS会损害细胞甚至导致细胞凋亡。POD能够清除植物体内活性氧，在植物抗病过程中也发挥着重要作用[19-20]。苏亚春等[21]的研究表明甘蔗ScPOD02基因在抗病品种中受黑穗病菌诱导显著，在中感及感病品种中不变或略微下调表达。Zhang等[22]在玉米上也发现了类似的现象：在黑穗病菌侵染后，抗病品种中POD基因上调表达，而在感病品种中下调表达，说明POD基因的表达水平与植物抗病性相关。

鉴于POD在植物抗逆防御反应中的重要作用，科学家们对POD基因及其编码的蛋白展开了大量研究。非洲菊(GerberajamesoniiBolus)是世界五大鲜切花之一，具有极高的经济价值[23]。目前有关非洲菊POD基因及其编码蛋白的研究较少。本研究中，从实验室前期获得的非洲菊转录组中筛选获得4条包含完整ORF的POD基因序列，对它们进行了克隆及生物信息分析，同时还研究了不同胁迫处理下这些基因和POD活性的变化特征，为揭示非洲菊POD基因的功能以及今后它们在非洲菊抗性育种中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料处理

试验用非洲菊‘玲珑’植株由福建农林大学园艺植物生物工程研究所和三明市农业科学研究院提供。

(1)器官取样：取非洲菊根、叶柄和叶片，备用。

(2)水杨酸处理：用100 μmol/L水杨酸(SA)喷洒非洲菊叶片至叶片滴水，并于处理后0、4、8 、12和24 h取叶片。

(3)PEG处理：用30%聚乙二醇(PEG)溶液一次性浇透土壤，并于处理后0、1、2 、3和6 h取叶片。

(4)低温处理：将非洲菊植株置于4 ℃光照培养箱中，分别于处理后0、4、8和12 h取叶片。

(5)根腐病菌接种：从28 ℃暗培养5 d的隐地疫霉菌落边缘挑取直径为0.5 mm菌块置于100 mL PDB培养基中，28 ℃条件下200 r/min振荡培养2 d，稀释3倍后备用。将非洲菊根部轻轻划伤后置于隐地疫霉菌液中2 h，移栽，并于处理后0、2 、4 和6 d取根系。

所有样品取样后立即置于液氮中速冻，之后置于-80 ℃超低温冰箱中，用于后续RNA提取及POD活性测定。

1.2 方 法

1.2.1酶活测定POD催化H2O2氧化特定底物，其产物在470 nm有特征光吸收，采用分光光度法，利用植物过氧化物酶试剂盒(购自苏州科铭生物技术有限公司)测定不同处理样品中POD活性。

1.2.2RNA提取及cDNA合成利用Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取非洲菊总RNA。采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒合成cDNA第一链用于POD基因cDNA的克隆。同时采用 TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)试剂盒(全式金)逆转录合成不同处理样品的cDNA用于qRT-PCR试验。所有步骤均参照试剂盒说明书进行。

1.2.3POD基因克隆及测序验证PCR 反应体系(25 μL)：Dream TaqTMGreen PCR Master Mix (2×) 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL。所用引物序列见表1。PCR 扩增程序为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ～59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。采用Gel/PCR Extraction Kit回收目的片段，连接pMD 18-T载体后转化DH5α感受态，经菌液PCR鉴定后选取阳性克隆子送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序验证。

1.2.4POD基因及蛋白生物信息学分析采用在线软件对POD基因及其编码蛋白进行基本理化性质分析(ExPASy，http://web.expasy.org/ protparam/)、信号肽鉴定(SignalP 4.1 Server，http://www.cbs. dtu.dk/ services/SignalP/)、亚细胞定位预测(CELLO:S，http://cello.life.nctu.edu.tw/)、跨膜结构预测(TMpred，http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED _form.html)、磷酸化位点预测(NetPhos 3.1 Server，http://www.cbs.dtu. dk/services/NetPhos/)、保守结构域分析(NCBI Conserved Domain Search，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi)、蛋白质二级结构预测(PSIPRED，http://bioinf.cs.ucl.ac. uk/psipred/)。从TAIR(https://www.arabidopsis.org/)中下载拟南芥POD蛋白序列，采用MEGA5.2.2邻近归并法(Neighbor-joining method)构建系统发育树。

1.2.5非洲菊POD基因表达分析以非洲菊18SrRNA为内参基因进行qRT-PCR试验。将不同cDNA样品等体积混样，随后按1、0.2、0.04、0.08、0.001 6倍进行梯度稀释用于绘制标准曲线。以稀释50倍的cDNA为模板，采用Roche Lightcycler 480荧光定量PCR仪进行相对表达分析。qRT-PCR扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共45个循环。qRT-PCR反应体系为SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)荧光染料 10 μL，ddH2O 7.4 μL，上下游引物各0.8 μL，模板1 μL。试验所用引物序列及相关信息见表1。采用Excel2003和SPSS17.0进行数据统计和差异显著性分析。

表1 实验所用引物信息

2 结果与分析

2.1 POD基因克隆及序列分析

在非洲菊转录组中查找获得4条具有完整ORF的POD基因序列，使用特异性引物(表1)进行PCR扩增，获得了1 000～1 200 bp PCR产物(图1)。NCBI Blastn比对发现：4个非洲菊POD基因分别与莴苣(Lactucasativa)POD4、向日葵(Helianthusannuus)POD5、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)POD7、向日葵POD42相似度最高，相似度分别为79%、76%、73%和88%。根据比对结果将它们分别命名为GjPOD4、GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42，GenBank登录号分别为MH708528、MH708531、MH708529和MH708530。它们的CDS分别为975 、966 、966 和1 005 bp，预测可分别编码324、321、321和334个氨基酸。4个GjPOD基因起始密码子均为ATG，GjPOD42和GjPOD5终止密码子为TAA，GjPOD7和GjPOD4的终止密码子为TGA。

M.DL2000；1～4分别代表GjPOD5、GjPOD4、GjPOD42和GjPOD7图1 PCR产物电泳图M.DL2000； 1-4 represent GjPOD5, GjPOD4, GjPOD42 and GjPOD7, respectivelyFig.1 Electrophoresis result of PCR products

2.2 生物信息学分析结果

2.2.1GjPOD蛋白基本理化性质分析结果蛋白理化性质分析显示，4个非洲菊POD蛋白均属于不稳定碱性蛋白，除GjPOD5外，均为亲水蛋白(表2)。GjPOD4中丝氨酸(Ser)含量最高，达12%，其次是丙氨酸(Ala)为9.9%；GjPOD5中亮氨酸(Leu)和丙氨酸(Ala)含量最高，均为11.2%，其次是丝氨酸(Ser)9.3%；GjPOD7丝氨酸(Ser)含量高达12.8%，其次是丙氨酸(Ala)，为9.3%；而GjPOD42中亮氨酸含量最高，达10.5%，其次是丝氨酸(Ser)，为7.2%。

2.2.2亚细胞定位及保守结构域分析结果亚细胞定位预测结果显示GjPOD4主要定位于叶绿体和胞外区，GjPOD5定位于液泡，GjPOD7主要定位于胞外区，GjPOD42主要定位细胞质。

保守结构域和结合位点预测发现，POD蛋白均含有完整的保守结构域(图2)，含有血红结合位点、活性位点、底物结合位点和钙离子结合位点，属于植物亚铁红素依赖Ⅲ型过氧化物酶超家族成员。Motif预测结果显示4个GjPOD含有5个相同的Motif(图3)。

2.2.3信号肽、跨膜结构域磷酸化修饰位点分析结果经信号肽预测发现4个POD在N端的1～26个氨基酸内含有信号肽。TMpred分析发现POD均含有由内向外和由外向内的跨膜螺旋结构。磷酸化修饰位点分析结果显示：GjPOD7含有磷酸化位点数最多，为40个，其次是GjPOD4和GjPOD42，分别为36和35个，而GjPOD5磷酸化位点最少，为22个(表3)。

2.2.4GjPOD蛋白质二级结构分析结果通过预测POD二级结构发现4个POD蛋白含有较多的α-螺旋和无规则卷曲。GjPOD4含有38.89%的α-螺旋和41.61%无规则卷曲，仅含有4.63%的β-折叠，其余14.81%为延伸片段；GjPOD5的α-螺旋的含量最高，为41.12%，无规则卷曲为38.32%，β-折叠和延伸片段分别为4.98%和15.58%；GjPOD7的α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠和延伸片段分别为38.32%、40.19%、5.30%和16.2%；GjPOD42的α-螺旋、无规则卷曲、延伸片段和β-折叠分别为40.42%、38.32%、15.2%和5.99%。

表2 4个GjPOD蛋白基本理化性质分析结果

下划线和红框分别表示保守结构域和血红素结合位点图2 多重氨基酸序列比对The underlined characters and the characters in the red box represent the secretory peroxidase conserved domain and heme binding site of POD, respectivelyFig.2 Multiple alignment of the amino acid sequences

图3 POD保守结构域和motif分析Fig.3 Aanlysis result of the identified conserved domains and motifs in POD proteins

蛋白Protein长度Length/aa信号肽Signal site跨膜结构域Transmembrane domain磷酸化修饰位点Phosphorylation site内→外Inside→Outside外→内Outside→InsideSTYGjPOD43241～26232862GjPOD53211～21421471GjPOD73211～242124124GjPOD423341～213319124

2.2.5聚类分析结果系统发育树分析结果表明：发现除AtPRX12和19外，大致分为5组，与拟南芥POD基因家族进化树结果类似[3](图4)。非洲菊4条POD并未聚在一起，GjPOD4和GjPOD7与拟南芥AtPRX52聚为一类，GjPOD5与拟南芥AtPRX47聚为一类，属于Group4，GjPOD42与拟南芥AtPRX42聚为一类，属于Group1(图4)。

2.3 不同器官及不同处理下POD活性及POD基因表达差异

2.3.1不同器官中POD活性及POD基因表达差异通过测定不同器官中POD活性发现：非洲菊叶片中POD活性最高，根和叶柄中活性相差不大(图5，A)，但未达到显著水平。

基因表达分析结果(图5，B)显示：GjPOD4在根和叶柄中的表达量极显著低于叶片(P< 0.01)，分别约为叶片的50%和10%；GjPOD5在根中的表达量显著高于叶片(P< 0.05)；GjPOD7在根中的表达量最高，其次是叶片，叶柄最低；GjPOD42在根中和叶柄中的表达量极显著低于叶片(P< 0.01)，仅约为叶片的10%。

At. 拟南芥；Gj. 非洲菊；红色代表GjPODs；Group1～Group5表示5组主要的PODs图4 POD系统发育树At. Arabidopsis thaliana, Gj. Gerbera jamesonii Bolus; Characters in red present represent the gjPODs; Group1-Group5 represent the five major POD groupsFig.4 Phylogenetic tree of PODs

*和**分别表示0.05和0.01水平显著性差异，下同.图5 不同组织器官中POD活性(A)以及基因表达(B)* and ** indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 levels, respectively. The same as belowFig.5 The POD activities(A) and POD expression patterns(B) in different organs of gerbera

相关性分析结果(表4)显示：在不同器官中GjPOD42基因的表达与POD活性呈显著正相关(P< 0.05)，GjPOD4基因的表达与POD活性有一定的正相关性，但未达到显著水平；GjPOD5和GjPOD7的表达与POD活性呈负相关，但也未达到显著水平(表4)。

2.3.2非生物胁迫下POD活性及POD基因表达差异在SA处理过程中，POD活性呈现出“升-降-升”的变化趋势，在4 h时活性最高，约为对照的2.5倍(图6，A)。4个基因的表达也均呈现“先升后降”的变化趋势(图6，B)，其中GjPOD4变化最明显，在4 h时表达量迅速升高，为对照组的30倍，8 h表达量为对照的23倍，之后虽有所下降但仍高于对照。GjPOD5表达量在SA处理4 h后极显著低于对照。GjPOD7与GjPOD42的表达水平在SA处理8 h达到最高，约为对照组的2倍，之后则极显著低于对照。相关性分析结果(表4)表明：在SA处理下，4个GjPOD基因表达水平与POD活性间不存在显著相关性，而GjPOD7与GjPOD42的表达水平间存在极显著正相关(P< 0.01)。

使用PEG处理模拟干旱胁迫，结果显示：在PEG处理条件下，POD活性呈现出“先升后降”的变化趋势，且均高于对照，并在3 h达到峰值，约为对照的2倍(图6，A)。GjPOD4基因的表达在1 h变化不大，在2 和6 h显著上调(约为对照的3倍)；GjPOD5基因的表达量在PEG处理早期(1 h)和6 h时极显著低于对照，而在2和3 h极显著高于对照；GjPOD7与GjPOD42的表达量在3 h时极显著高于对照(图6，D)。相关性分析结果(表4)显示：在PEG处理条件下，POD基因的表达与活性无显著相关性，而GjPOD7与GjPOD42的表达水平间存在极显著正相关(P< 0.01)，GjPOD4与GjPOD7、GjPOD4与GjPOD42的表达水平间存在一定负相关性。

表4 POD活性与POD表达水平相关性分析

注：* 表示在0.05水平上(双侧)显著相关，**表示在0.01水平上显著相关

Note: * indicates significant correlation at the 0.05 level (bilateral), ** indicate significant correlation at the 0.01 level

A.不同处理；B.水杨酸处理；C.低温(4 ℃)胁迫；D.PEG干旱处理；E.病原菌处理图6 不同处理下POD活性(A)及其GjPOD基因(B～E)表达情况A. The different treatments；B. SA treatment；C. Cold(4 ℃)stress；D. PEG treatments；E. Pathogen treatmentFig.6 The POD activities (A) and GjPOD gene expression patterns (B-E) under different treatments

在4 ℃低温处理下，非洲菊叶片POD活性呈“升-降-升”的变化趋势，且均高于对照，在12 h时活性达到最高，为对照组的3倍(图6，A)。GjPOD4基因的表达呈现“升-降-升”的变化趋势，在低温处理8 h时显著低于对照；而低温处理却极显著抑制GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42基因的表达，在12 h时的表达量相对于对照分别下降了2倍、11倍和11倍，但GjPOD5在12 h上调表达(图6，C)。相关性分析结果(表4)表明：POD基因的表达与POD活性间不存在显著相关性，而GjPOD5与GjPOD7、GjPOD5与GjPOD42的表达水平间存在显著正相关(P< 0.05)，GjPOD7与GjPOD42的表达水平间存在极显著正相关(P< 0.01)。

2.3.3隐地疫霉处理对非洲菊POD活性及POD基因表达的影响接种隐地疫霉2 d后，非洲菊植株叶片出现轻微失水的现象，而此时根系中POD活性迅速升高，约为对照的2倍，之后活性开始下降但仍高于对照(图6，A)。GjPOD4、GjPOD7和GjPOD42的表达在响应根腐病的过程中均呈现“先升后降”的变化趋势，在4 d时表达量最高，分别约为对照的3倍、3倍和4倍，为2 d时的1.84倍、1.06 倍和1.2倍；而GjPOD5则呈现出“升-降-升”的变化趋势，2 d时的表达量最高，约为对照组的2倍，且存在极显著差异(P< 0.01)，4 d时的表达量低于对照组，6 d时的表达量略高于对照组(图6，E)。相关性分析结果(表4)表明：在隐地疫霉处理条件下，4个基因的表达与活性虽未达到显著水平，但均呈一定的正相关性，而GjPOD7与GjPOD42的表达水平间存在显著正相关(P< 0.05)，GjPOD4与GjPOD5的表达水平间存在一定的负相关。

3 讨 论

POD是植物抗氧化系统中的关键酶之一。本研究基于非洲菊转录组结果，筛选获得4个具有完整CDS的POD基因(GjPOD4、GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42)，并利用RT-PCR技术从‘玲珑’非洲菊中克隆获得这些基因cDNA序列。蛋白序列分析结果表明这4个POD基因所编码的蛋白均属于植物亚铁红素依赖Ⅲ型过氧化物酶超家族成员。通过对这些基因进行生物信息学和表达分析，同时结合POD活性，发现GjPOD广泛参与非洲菊抗逆防御反应，此外本研究还发现这4个GjPOD基因存在一定的功能冗余但也有所差异。

3.1 GjPOD基因广泛参与非洲菊抗逆防御反应

Class Ⅲ POD为植物所特有，包含多种同工酶和基因结构，其功能多样性，能够广泛参与植物体内多种代谢活动。

POD基因不仅可以被植物激素调节，也可以被干旱等多种非生物胁迫调节，在植物抗逆防御反应过程中也同样发挥着重要作用[5, 24-25]。过表达APX基因可以增加红藻的耐热性、提高低温下烟草种子的萌发率、增强转基因烟草的耐寒性、提高水稻孕穗期的耐寒性和结实率[26-28]。本研究中的研究发现在低温、干旱(PEG模拟)条件下GjPOD基因均会出现差异表达，暗示它们在非洲菊抵御非生物胁迫反应中发挥着作用。

POD在植物抗病过程中的重要作用已在多个物种中得到验证[21-22, 25, 29-30]。Hilaier等[29]发现水稻叶片感染白叶枯病菌后OsPRX114上调表达；Choi等[25]发现辣椒在响应病原菌入侵的过程中，CaP02基因能够参与调控H2O2水平，并且H2O2水平与编码病原相关蛋白基因的表达密切相关。本研究中，GjPOD4、GjPOD7和GjPOD42的表达在各个时间点均受根腐病菌侵染诱导显著，而GjPOD5在感病初期(2 d)也极显著上调，说明它们在非洲菊响应根腐病菌入侵的过程中发挥着重要作用。

3.2 GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42间可能存在一定的功能冗余

通过分析非洲菊4条POD基因编码蛋白序列，发现它们拥有相同的保守结构域和motif，暗示它们的功能和作用方式可能比较相似。基因表达分析发现，这些基因尤其是GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42在不同处理下的变化趋势大致相同。此外，相关性分析结果也表明它们的表达水平在各种处理下多存在显著或极显著正相关，说明它们之间可能存在功能冗余。

3.3 GjPOD4可能具有不同的功能

植物中存在不同的POD亚型，定位在细胞质、过氧化物酶体、线粒体和叶绿体等不同的细胞器中，亚细胞定位不同可能与其功能有关。本研究亚细胞定位预测结果显示GjPOD4主要定位于叶绿体和胞外区，暗示其可能为胞外分泌/细胞壁类型的PRX家族成员，参与细胞壁的新陈代谢，如木质素的聚合反应[30]。GjPOD4基因的表达趋势除在隐地疫霉处理下与GjPOD7和GjPOD42相近外，在其他处理条件下与其他3个GjPOD差异极大。在SA处理早期的GjPOD4受诱导程度也显著高于其他GjPOD，推测其可能参与植物系统获得性抗性[17]。以上结果表明GjPOD4的功能可能与其他GjPOD有所差异。