铁皮石斛同源四倍体工厂化快繁工艺研究

刘静雯，梁晖辉，卢富华，李瑞兰，党仪泉，向增旭

(南京农业大学 园艺学院，南京 210095)

如今铁皮石斛的人工种植方法有许多[14]，而植物组织培养中传统的铁皮石斛茎段繁殖速度慢，增殖系数低，不能满足大量的工厂化育苗要求，因此育苗成为解决当前铁皮石斛工厂化生产的一个迫切问题。本研究在实验室前期铁皮石斛倍性研究的基础上，对铁皮石斛组培快繁技术的方法展开进一步的研究，探究铁皮石斛同源四倍体的快繁途径。通过诱导原球茎的发生、增殖、分化，建立一种与传统茎段、分株繁殖不同的繁殖方法，探寻铁皮石斛同源四倍体种质保存、大规模扩繁和生产推广应用的新技术，从而找出一种更快速、高效的方法用于开发铁皮石斛的优良品种，为铁皮石斛同源四倍体植株的种苗工厂化生产奠定新的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料是经南京农业大学中药材研究所向增旭教授鉴定的铁皮石斛植株，铁皮石斛同源四倍体为实验室前期研究的同源四倍体株系。

1.2 试验方法

1.2.1铁皮石斛同源四倍体纯合性鉴定随机选取铁皮石斛同源四倍体株系‘花自-2’的无菌试管苗，转入无激素的MS培养基预培养，20 d后再转接到生根培养基进行生根培养。通过观察试管苗叶片大小、叶色、株高、茎粗等表观特征，初步判断四倍体。气孔鉴定：于超净工作台中选取‘花自-2’材料及对照株(CK)相同生长部位的叶片，用摄子撕取叶片下表皮临时装片，在显微镜下镜检拍照，随机选取10个视野进行气孔计数，观察每个视野气孔大小及气孔密度。染色体鉴定：早上9：00～11：00取幼苗根尖(0.5～1 cm)，在冰水混合物中预处理24 h，于4 ℃冰箱中卡诺固定液(乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定24 h，在60 ℃ 1 mol/L HCl中解离5 min，卡宝品红染色10 min，然后制片、镜检。流式细胞仪分析：称取0.5 g组培苗叶片，用滤纸吸干水分后置于干净培养皿中，加入2 mL预冷的组织解离液[80 mmol/L KCl, 20 mmol/L NaCl, 15 mmol/L Tris-HCl, 20 mmol/L Na2EDTA, 0.1%(V/V) TritonX-100, 2.0%(V/V) PVP-K30, pH 7.5]，用刀片一次性快速切碎叶片，过滤后于4 ℃ 2 000 r/min离心5 min，漂洗2～3次，加入2 mL DAPI染液室温下反应1 h后即可上样测定。

1.2.2原球茎的诱导及生根鉴定以同源四倍体幼嫩茎段为试验材料，以MS为基本培养基，选用5种激素组合对铁皮石斛原球茎的诱导培养基进行优化，把切好的茎段接种在供试培养基上(表1)，用镊子轻轻按压使茎段与培养基充分接触，以便更好地吸取养分。每瓶接种4个茎段，每个处理重复10次。接种后定期观察茎段诱导原球茎过程，统计诱导出原球茎的茎段个数及诱导产生原球茎所需时间，探究不同浓度激素配比对原球茎诱导率的影响，筛选原球茎诱导最佳培养基。

在超净工作台上，将增殖的原球茎分割成团块转入供试生根培养基中，选用生长素NAA、基本培养基和香蕉汁为3个试验因素，激素NAA浓度设0、0.5 和1.0 mg/L 3个水平，基本培养基设置1/2 MS、MS和1/4 MS 3个水平，香蕉汁设计5%、10%、15% 3个水平。本试验不考虑因素间的交互作用，各因素随机排列，采用L9(33)正交表，进行3因素3水平(表2)正交试验，共9个处理。每个培养基放入5团原球茎，每组试验设10个重复，生根周期设定时长为6周，试验结果以每株苗平均生根数量为评价指标。将由四倍体茎段诱导产生的原球茎放入最佳生根培养基中生根，同时把新生的根进行预处理，进行根尖染色体鉴定工作。

1.2.3原球茎的增殖将由嫩茎诱导形成的原球茎接种在供试原球茎增殖培养基上。根据天然复合物马铃薯的添加可以促进增殖与发育[15]，因此选用MS+15%马铃薯提取液为基本培养基。选用NAA、6-BA、KT为3个试验因素，KT设0、0.2和0.5 mg/L 3个水平，6-BA设0.2、0.5 和1.0 mg/L 3个水平，NAA设0.2、0.5 和1.0 mg/L 3个水平。本试验采用3因素3水平正交试验(表3)，共9个处理，每个处理重复5次，每瓶接入5团原球茎。在超净工作台上，选取长势均匀一致的原球茎，按压接种至供试培养基，每5 d观察原球茎增殖状况，生长状况及分化程度。

表1 备选原球茎诱导培养基

表2 生根培养基选择正交试验表

1.2.4原球茎的分化将由茎段诱导产生的增殖充分成熟的较大原球茎块切割成直径5～8 mm左右的小块，放入培养基中，探究6-BA与NAA不同激素水平对原球茎分化影响的试验(表4)，在无菌条件下进行分化培养，50 d后统计不同培养基的原球茎分化率，确定原球茎分化的最适激素组合浓度。

在激素确定的基础上，往培养基中添加不同浓度的香蕉汁和马铃薯提取液探究外源有机物对原球茎分化的影响，从而选择适宜原球茎分化的最佳有机物，以此确定原球茎最佳分化培养基。

前列腺位于盆腔深部，位置低、空间小，是机器人在泌尿外科的主要应用方向之一。与传统腹腔镜手术相比，机器人前列腺癌根治术可明显降低术中出血、缩短导尿管留置时间，同时减少围手术期并发症[6]。由于机器人手术开展时间短、经验积累尚不丰富，如何快速培养年轻医师，使之迅速掌握机器人手术技巧，已成为目前亟待解决的问题。

表3 原球茎增殖配方正交试验表

表4 不同激素水平对原球茎分化的影响

1.3 幼苗的转接壮苗、练苗与移栽

将原球茎分化的幼苗选择合适的培养基，进一步转接壮苗，待幼苗长到适宜程度时，进行铁皮石斛同源四倍体的炼苗，选择不同炼苗时长，进行培养钵移栽试验，记录生长环境的温度和浇水状况，依据移栽后铁皮石斛同源四倍体植株的的长势，确定最佳的练苗时长、移栽时间和生长环境。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛‘花自-2’倍性鉴定结果

通过采用形态鉴别、气孔解剖、根尖染色体计数及流式细胞仪分析相结合的方法，确定了‘花自-2’株系为纯合的同源四倍体。在形态方面，四倍体株系与对照株系相比整体表现矮壮(图1)；相同倍镜下气孔变大，密度与二倍体相比有所降低，在物镜×40视野下气孔的密度降低近1倍(图2)；‘花自-2’染色体数为76条，而对照组株系根尖染色体数为38条，‘花自-2’染色体数目加倍(图3)；经流式细胞仪分析，对照株系DNA相对含量在100处出现峰值，‘花自-2’株系在200处出现峰值(图4)，也标明‘花自-2’为纯合的同源四倍体。综合以上4种方法，确定了实验室前期诱导的铁皮石斛‘花自-2’为纯合的同源四倍体。

2.2 铁皮石斛同源四倍体原球茎的诱导

由表5的试验结果分析可知：以同源四倍体幼嫩茎段为试验材料，MS培养基为基本培养基时，添加不同浓度的6-BA、NAA、KT、IBA、2, 4-D等5种激素相互组合对茎段进行诱导处理，其诱导情况都明显高于不添加任何激素的对照组。5种激素组合中以添加1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L KT + 0.0 mg/L IBA+0.0 mg/L 2, 4-D等5种激素浓度的组合培养基对铁皮石斛同源四倍体原球茎的诱导最好，幼嫩茎段诱导原球茎的诱导成功率最佳，平均诱导率达到76.66%。

左.对照组(CK)；右.‘花自-2’图1 铁皮石斛生根苗形态Left. CK；Right. ‘Huazi-2’Fig.1 Rooting seedling form of D. of ficinale Kimura et Migo

‘花自-2’(上)与对照CK(下) 物镜×10(左)、物镜×40(右)图2 铁皮石斛叶片气孔图‘Huazi-2’ (upper) and CK (lower), objective lens×10 (left) and objective lens×40 (right)Fig.2 Leaf stomata of D. of ficinale Kimura et Migo

左.对照组(CK)；右.‘花自-2’图3 铁皮石斛根尖染色体图Left. CK；Right. ‘Huazi-2’Fig.3 Root tip chromosome of D. of ficinale Kimura et Migo

左.对照组(CK)；右.‘花自-2’图4 铁皮石斛流式细胞仪分析图Left. CK；Right. ‘Huazi-2’Fig.4 Flow cytometry analysis of D. of ficinale Kimura et Migo

编号No.激素浓度Hormone concentration /(mg/L)KTNAA6-BAIBA2, 4-D诱导率Inductivity/%10000012.4321.00.20.50044.5431.00.50.20043.3342.00.20.50047.8652.00.50.20059.9960.50.21.00066.4570.20.51.00076.6680.50.22.00043.3390.20.52.00055.6810001.00.21.035.4611001.00.51.032.3112002.00.22.044.5413002.00.52.042.3314001.00.50.233.4515001.00.20.535.6116002.00.50.234.3717002.00.20.537.88

2.3 原球茎的生根培养及染色体鉴定

将原球茎分开后放入不同的供试生根培养基中，不同生长素NAA浓度、基本培养基及香蕉汁对铁皮石斛原球茎生根率均可产生影响。从表6中可以看出NAA浓度选择0.5 mg/L时，铁皮石斛原球茎的生根率高于其他2组；不添加NAA的培养基铁皮石斛原球茎的生根速度慢，生根率较低且根尖不明显；而以1/4 MS、MS为基本培养基生根状态均不如以1/2 MS为基本培养基的生根状态。香蕉汁的添加量暂时没有太大的差别可循。因此最佳生根培养基组合是：NAA浓度选择0.5 mg/L、1/2 MS培养基、15%香蕉汁，其生根率可达92.77%。

圆球茎转入生根培养基40～50 d后，取颜色亮白，形状细长，且根尖状态良好的根，进行根尖染色体再鉴定，经鉴定原球茎所生根的根尖染色体数仍为76条，表明诱导的倍性可稳定遗传。

2.4 铁皮石斛同源四倍体原球茎的增殖与分化

2.4.1原球茎增殖试验表明：在MS +15%马铃薯提取液培养基中添加不同种类激素，原球茎增殖系数均出现不同程度变化。从表7可知：在适宜激素浓度比例下，原球茎增殖未出现玻璃化现象或玻璃化程度较轻，其中原球茎增殖较好的是6号培养基，增殖系数远比期待数值要高。含有较高浓度激素的KT培养基，原球茎的长势均不如低浓度的KT培养基与不加KT 的培养基。另外原球茎的增殖系数在NAA浓度较低的范围内培养效果较好，随着浓度的增加，原球茎的增值系数受到限制。在较低浓度范围内原球茎增殖系数随着6-BA浓度的增加有所上升，1.0 mg/L 6-BA原球茎增殖程度高。综上所述：最优增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+15%马铃薯提取液。

2.4.2原球茎分化本试验在1/2 MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA、6-BA探究对原球茎分化的影响。从表8的试验结果中可知：以1/2 MS为基本培养基，加入不同浓度的NAA、6-BA对原球茎的分化影响显著。如表中所示，不添加激素的7号培养基，分化率明显低于含有不同激素水平的培养基；仅添加6-BA的组别(编号1、2)原球茎分化程度明显高于其他组，且0.5 mg/L水平下的6-BA对原球茎分化率高于0.2 mg/L水平；单独添加NAA的组别(编号3、4)分化芽数低于两种激素都添加的组别(编号5、6)和仅添加6-BA的组别(编号1、2)，且NAA浓度越高，分化率越低。因此，原球茎分化最佳的激素水平为0.5 mg/L 6-BA，其圆球茎分化率达到85.70%。

表6 生根培养基试验结果表

表7 不同组别对原球茎增殖的影响

注： +、++、+++和++++ 为原球茎增殖程度升序排列：+表示少数原球茎，增殖差，++表示原球茎增殖一般，+++表示原球茎增殖较好，++++ 表示原球茎增殖极好

Note：The +, ++, +++ and ++++ for protocorm proliferation degree in ascending order: + minority protocorm proliferation, ++ normal protocorm multiplication, +++ better protocorm multiplication, ++++ excellent protocorm proliferation

在1/2MS培养基中加入0.5 mg/L 6-BA的基础上，加入有机复合物马铃薯提取液与香蕉提取液来探究对原球茎的分化的影响。通过观察，添加20%马铃薯提取液的养基分化明显，苗长势好于添加20%香蕉提取液与对照(CK)的培养基。因此选择20%马铃薯提取液作为原球茎分化培养试验的有机物添加。由此可知：铁皮石斛原球茎分化最佳培养基为1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+20%马铃薯提取液。

2.5 幼苗的转接壮苗、练苗与移栽

将幼苗转入合适的培养基进一步壮苗，待幼苗长到适宜程度时，进行铁皮石斛同源四倍体组培苗的炼苗。试验结果表明，不同的炼苗时长，对铁皮石斛同源四倍体幼苗的成活率影响不同。根据试验记录可知，铁皮石斛同源四倍体植株的最佳的练苗时长为5 d、其移栽成活率最高，成活植株可达92.30%。

2.6 铁皮石斛同源四倍体工厂化组培工艺流程

试验前期一直采用茎段快繁铁皮石斛同源四倍体的途径来对现有的同源四倍体株系进行扩繁。试验表明：茎段繁殖的增殖系数低，虽然添加有机复合物的培养基可以使增值系数在一定程度上有所增加，但仍不能满足工厂化生产需求。而通过原球茎诱导、增殖与分化的途径来进行增值，其增值系数大大提高，从而可以逐步满足工厂化生产的需求。原球茎的诱导、增殖与分化并进行完整工艺流程如图5所示。

表8 不同激素水平对原球茎分化的影响

图5 铁皮石斛同源四倍体组培快繁工艺流程图Fig.5 D. of ficinale Kimura et Migo homologous tetraploid’s engineering flow sheet

3 讨 论

在多倍体诱导研究中，首先观察外部形态特征可初步判断四倍体株系，该方法最为简便快捷；其次利用显微镜观察气孔等显微结构，可做进一步的判断。显微结构是利用根尖细胞染色体数目来判断植株倍性。本试验的方法步骤和韩超等[16]的桉树压片过程有所不同，我们用冰水混合物代替了8-羟基喹啉处理，使试验操作更具安全性。然而在染色体鉴定工作中，还存在许多人为控制的因素制约着压片的成功率，因此，流式细胞仪的鉴定方法在倍性判断方面，可以在提高鉴定效率的基础上，保证倍性鉴定结果的可靠性，而且以上几种方法结合，更加确定了倍性纯合的可靠性，本试验研究结果与王荣邦等[17]的菊花染色体倍性鉴定研究结果相一致。

本试验以铁皮石斛同源四倍体的幼嫩茎段为外植体成功诱导了原球茎的产生，选择的茎段以1.5～2.5 cm并带有1～2个茎节为宜，茎段诱导产生原球茎的最佳培养基为MS +1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L KT，诱导率为76.66%，且诱导出的原球茎紧密度适中，长势好，色深绿;与朱庆竖等[18]铁皮石斛的原球茎诱导的最适宜培养基为1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 2, 4-D有相同也有不同。

进行铁皮石斛同源四倍体的倍性再鉴定，证明了诱导的倍性可稳定遗传。研究发现在原球茎的诱导过程中由茎段萌生的原球茎在特定激素浓度下存在分化成苗的趋势，而在原球茎增殖试验中也存在部分原球茎分化的现象，由此而来，在整个试验过程中，增殖的同时会伴有分化现象。在原球茎的增殖过程中，发现有出苗不整齐的现象，从而导致原球茎发育成苗的不同步化。所以在试验过程中，必须探究出一种最适宜的培养条件使原球茎以均匀的速度同步生长，来更好地满足工厂化育苗的需求。这种条件不仅与内源状态有关，还可能与室温、光照等息息相关。

本试验探究了不同添加激素种类与浓度、有机物的种类与浓度对原球茎的增殖与分化的影响，以四倍体铁皮石斛的幼嫩茎段作为外植体进行原球茎的诱导，可以通过原球茎的增殖与分化最终获得大量的植株，加快了铁皮石斛的繁殖效率。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+15%马铃薯提取液为原球茎最适宜的增殖培养基；最佳的原球茎分化的配方为1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+20%马铃薯提取液，与朱庆竖等[18]研究的原球茎分化最适宜培养基为1/2 MS+1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT，陈潇倩[15]的1/2 MS+0.2 mg/L 6-BA+20%马铃薯提取液, 有些不同。试验中证明了添加马铃薯提取液、香蕉汁能有效地促进铁皮石斛原球茎的分化，这与杨柳平等[19]研究得出的添加香蕉汁会抑制圆球茎的分化结果不同，而与方中明等[20]香蕉能促进原球茎的分化研究结果相同。

试验也进行了茎段扩繁培养基的筛选，结果表明，茎段扩繁的最佳培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+15%香蕉汁，但茎段扩繁增殖系数低，不能满足大规模种苗工厂化生产的需要；以幼嫩茎段为外植体诱导铁皮石斛同源四倍体原球茎，通过原球茎增殖、分化及生根培养，建立了比茎段繁殖效率更高的铁皮石斛同源四倍体高频快繁技术体系，为铁皮石斛同源四倍体种质的生产推广提供了技术支撑。