miR-27a rs895819与胃癌临床病理特征及预后的相关性＊

刘冬兰，王艳华，廖瑜倩，万以叶

(江西省肿瘤医院肿瘤内科，南昌 330029)

全世界每年约有一百余万例新发胃癌患者，其致死率已排在肿瘤导致死亡原因的第二位[1]。我国胃癌是发病率及死亡率均排名第二位的恶性肿瘤，占全球胃癌的48%，发病最高的地区分布于我国西北及东部沿海区域[2]。胃癌术后有50%以上的患者将出现复发或转移，这些患者5年生存率仅4-5%[3]，因此术后行辅助化疗预防复发转移，这将具有重要意义。胃癌术后辅助化疗药物主要有两大类，即铂类及氟尿嘧啶类[4]。目前我们迫切需要发现一些分子标志物，它将预测胃癌的术后局部复发或远处转移，从而指导胃癌的个体化治疗。微小核糖核酸（miRNA)是一类大约有20-22个核糖核酸组成的非编码RNA，它具有高度保守性，且能调节相关基因的表达，逐渐成为新的分子标志物[5，6]。miRNA能降解mRNA或阻碍其翻译，在其下游信号通路调控蛋白质的表达[7]。微小核糖核酸单核苷酸多态性（miRNA SNP)位于miRNA前体或成熟结构中，它能改变miRNA的数量和质量[8，9]。有研究表明miRNA相关基因的单核苷酸多态性与胃癌的发病有关[10]。目前miRNA-27a rs895819与胃癌发临床病理特征及生存的研究相对较少。本研究在胃癌术后接受奥沙利铂联合氟尿嘧啶类患者中分miRNA-27ars895819与临床病理特征及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2011年1月至2012年12月江西省肿瘤医院手术的胃癌患者，共98例，均经术后病理证实；通过D2，R0手术切除（ⅠB-Ⅲ期）；术后均接受奥纱利铂联合氟尿嘧啶类药物辅助化疗6个月，未接受术前新辅助化放疗或辅助放疗。

1.2 治疗方法 辅助化疗方案具体为：⑴84例患者使用mFOLFOX6方案，奥沙利铂85mg/m2ivgttd1+亚叶酸钙400mg/m2ivgttd1+氟尿嘧啶400mg/m2ivd1+氟尿嘧啶 2400mg/m2civ46h，Q2W×12次。⑵8例患者使用XELOX方案，奥沙利铂130mg/m2ivgttd1+卡培他滨 1000mg/m2pod1-14，Q3W×8次。⑶6例患者使用SOX方案，奥沙利铂130mg/m2ivgttd1+ 替 吉 奥 40-60mgpobidd1-14，Q3W×8次。

1.3 观察指标 全组患者每3个月进行影像学评价了解患者复发转移情况，记录无病生存期及总生存期。

1.4 miRNA SNP检测方法 全组患者在化疗前采集外周血标本5ml。采用Sequenom实验方法进行SNP分型检测。具体流程：首先整理SNP序列信息成标准格式；结合文献并采用AssayDesigner3.1软件进行引物设计，确定目的位点：5'-ACGTTGGATGGGAACTTAGCCACTGTGAAC -3'（上游引物）和5'-ACGTTGGATGAGGGCTTAGCTG CTTGTGAG-3'（下游引物）；合成引物，引物稀释，样本检测定量；PCR扩增反应；384孔SAP纯化反应；384孔单碱基延伸反应，树脂纯化，上机检测，收集数据。由北京博淼生物公司合成及检测。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析。采用Kaplan-Meier法进行生存单因素分析，组间比较采用Log-rank检验，采用COX分险比例模型进行多因素预后分析。所有的统计检验均为双侧概率检验。

表1 miRNA-27a rs895819与临床病理特征的关系

2 结果

2.1 全组患者的基本特征 全组患者男性69例，女性 29例，69例患者年龄＜60岁，29例患者年龄≥60岁。90例患者病灶位于非贲门部（91.8%），8例位于贲门部（8.2%）。27例（27.6%）高分化腺癌，71例（72.4%）低分化及印戒细胞癌。浸润深度T1-219例（19.4%），浸润深度 T3-479例（80.6%）；淋巴结转移69例（70.4%）；37例（37.8%）Ⅰ-Ⅱ期，61例（62.2%）Ⅲ期。

2.2 miRNA-27a rs895819与临床病理特征的关系miRNA-27a rs895819 基因型（AA，AG，GG)及显性模型、隐性模型均与胃癌术后临床特征无相关性。（见表 1）。

2.3 miRNA-27a rs895819及临床病理特征与无病生存和总生存的关系 ＜60岁患者3年无病生存率为42.19%，≥60岁患者 3年无病生存率为 41.71%。全组患者3年总生存率为73.4%。浸润深度与3年无病生存率明显相关。T1-2患者的3年无病生存率明显高于T3-4，分别为73.53%和32.43%（P=0.011）。临床分期与3年总生存率显著相关，Ⅰ-Ⅱ；Ⅲ期患者3年总生存率分别为91.51%和56.92%。基因分型与3年总生存期明显相关，AA，AG，GG基因型3年总生存期分别为79.55%，74.6%，33.33%（P=0.012）；部位（P=0.56)，分化程度（P=0.160)和N分期（P=0.063)与3年总生存期无明显相关性。隐性模型中，AA+AG基因型患者的3年总生存率显著高于GG型，分别为77.22%和33.33%。见表2。COX多因素分析显示，淋巴结状态（P=0.014，RR=6.027，95%CI 1.478-32.590) 和rs895819 基因型 （P=0.004，RR=8.281，95%CI 0.025-0.496）为总生存的独立影响因素。见表3。

3 讨论

miR-27a rs895819位于19号染色体短臂上，处于pre-miRNA-27a茎环结构发夹中，会被核糖核酸内切酶（Dicer酶）切割，而影响miRNA-27a前体的成熟[11]。rs895819碱基A＞G突变可缩短茎环结构，阻碍 miRNA-27a 的成熟[12，13]。 miRNA-27a rs895819与恶性肿瘤的发生，发展可能有关。中国学者刘芳腾[14]Meta分析显示pre-miR-27a基因rs895819多态性与大肠癌易感性之间具有相关性，并且GG突变型具有增加罹患大肠癌的风险。刘春桃等[15]研究显示miR-27a rs895819基因多态性与宫颈癌发生可能无关。而Sun[16]的研究发现，胃癌的发病风险在rs895819杂合型/突变型（AG/GG）均增加，分层分析发现老年不吸烟的农村男性（＞58岁）发病风险明显增加，究其原因是rs895819影响了miRNA-27a的表达量；另外发现rs895819杂合型/突变型（AG/GG）与淋巴结转移明显相关，与胃癌的发病部位，浸润深度或肿瘤分级不相关。本实验结果显示，miRNA-27a rs895819基因型与胃癌临床特征不相关，这可能与病例数有关，需要扩大入组患者，在以后的研究中进一步证实。

表2 临床病理特征、遗传变异与生存的关系

表3 COX预后多因素分析

Wu等[17]研究显示，收集的273例胃癌组织中，miR-27a的表达量均高于相对应的癌旁正常组织，miR-27a的表达量增加，促进了胃癌细胞的进一步增殖，迁移，转移，它是通过Wnt/β-catenin信号通路作用于其靶基因SFRP1而实现其致癌功能的。Ding[18]学者同样发现，miR-27a表达量在胃癌组织中增高，miR-27a表达增高与胃癌脏器转移，淋巴结转移，局部浸润深度和TNM分期有关，miR-27a通过作用于PHLPP2，激活下游AKT/GSK3β信号通路，最后导致胃癌的增殖及转移。我们的后续研究将增加病理组织miR-27a表达量的检测，以明确miR-27a表达量对预后的影响。

Xu[19]临床试验得出miR-27a rs895819基因多态性与临床特征及胃癌的生存均不相关，但在亚组分析中，TNMⅠ-Ⅱ期患者，rs895819杂合型（AG）较野生型（AA）生存具有优势，在淋巴结转移及脏器转移中，携带rs895819杂合型和突变型（AG+GG）比纯野生型（AA）生存期更长。而我们的研究结果与之不一致，我们得出rs895819纯突变型GG较杂合子AG、野生型AA预后均差，其可能与纯突变型过表达mir-27a，促进胃癌细胞侵袭和增殖有关，这与既往其他文献报道结果基本一致。Li J研究[20]结果显示miR-27a的表达上调，使人肺腺癌细胞对顺铂产生耐药，miR-27a通过抑制RKIP靶基因，而RKIP可能通过NF-kB/Snail而引起顺铂的耐药[21]。另有学者[22]对膀胱癌细胞研究显示，miR-27a抑制靶基因SLC7A11，使肿瘤细胞对顺铂产生耐药，如果下调miR-27a的表达或用SLC7A11的抑制剂柳氮磺胺吡啶，将能逆转癌细胞对顺铂药物的耐药。另有研究[23]发现miR-27a的表达可能影响白种人5-氟尿嘧啶药物的代谢，如果既存在miRNA-27a rs895819，又有DPD风险变异，＞70%白种人患者早期将出现严重的氟尿嘧啶的毒副反应；而无DPD变异下，miRNA-27a rs895819可能调节Bcl-2蛋白家族中的两位成员，即Bcl-2和Bax。miR-27a rs895819是否会影响胃癌奥沙利铂的敏感性及我国5-氟尿嘧啶药物的代谢目前还不清楚，需要进一步的临床试验验证。

本研究实验证实，miRNA-27a rs895819A/G基因多态性与胃癌术后病理特征无关，可能与胃癌术后预后相关，野生型+杂合型（AA+AG）患者与纯突变型（GG）患者相比，生存期均延长，预后更好。但本研究入组患者有限，可能与真实的结果有一定的偏差，今后还需扩大样本进一步验证，并进行更深入的机制研究。