盐酸副玫瑰苯胺法测定当归药材中二氧化硫残留量的不确定度评定＊

刘玲 ，陶松 ，刘立民 ，张梦颖 ，张五萍 ，林婷婷

(1、江西省人民医院药学部，南昌 330006；2、南昌大学第一附属医院药学部，南昌 330006)

当归是我国常用中药材之一，具有补血活血，调经止痛，润肠通便。用于血虚微黄，眩晕心悸，月经不调，经闭痛经，虚寒腹痛，风湿痹痛，跌扑损伤，痈疽疮疡，肠燥便秘[1]。一些不法商人在加工当归的过程中，用硫磺薰蒸以防虫防霉，导致当归饮片中残留有二氧化硫。过量的二氧化硫残余，使服用者易产生恶心、呕吐等胃肠道反应及眼、鼻粘膜刺激症状，严重时易产生喉头痉挛水肿等[2]，因此测定当归中二氧化硫含量具有重要意义。

测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相关联系的参数。不确定度可以是标准偏差或其倍数，或是说明了置信水平区间的半宽度[3]。由于测量不确定度是对测量结果的定量表征，中国合格评定认可委员会（CNAL）在对实验室进行认可时，都要求开展测量不确定的评定[4]。本文采用盐酸副玫瑰苯胺法测定当归药材中二氧化硫残留量，根据国家质量技术监督局发布的计量技术规范 《测量不确定度评定与表示》（JF1059-1999）中有关规定，对盐酸副玫瑰苯胺法测定当归药材中二氧化硫残留量过程进行分析，量化了各不确定度分量，并提出了该法的合成不确定度。通过评定与分析，以减少检测过程中的误差，以提高检测结果的准确性。

1 原理

测量不确定度是与测量结果相关联的参数，它合理地赋予被测值的分散性。该分散性主要涉及到A类不确定度、B类不确定度和合成标准不确定度[5]。⑴A类不确定度：由一系列测量结果统计分布计算，用试验标准偏差表征，一般由贝塞尔公式法s=计算得。⑵B类不确定度：基于经验或其它信息的概率分布估计出来，用标准偏差表征。⑶合成标准不确定度：将A类不确定度、B类不确定度的平方和开方的方法叠加起来给出合成标准不确定度。 由此公式 uc[y （x1，x2…）]=计算得合成标准不确定度。测量不确定度评估过程包括如下步骤：步骤1.详细说明被测量；步骤2.识别不确定度来源；步骤3.量化不确定度；步骤4.计算合成不确定度。

2 方法与结果

2.1 仪器与材料 UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）；AUW220D型电子分析天平（日本岛津公司）；HHS型电热鼓风干燥箱 （上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；梅特勒-托利多AB104-N型万分之一天平；四氯汞钠吸收液；氨基磺酸铵溶液（12g/L）；甲醛溶液（2g/L）；淀粉指示液；亚铁氰化钾溶液；乙酸锌溶液；盐酸副玫瑰苯胺显色剂；碘溶液[C(1/2I2)=0.10mol/L]；硫代硫酸钠标准溶液[C(Na2S2O3·5H2O)=0.100mol/L]；二氧化硫标准溶液（以上试剂均为分析纯）。当归（生产批号：170801，亳州市佰世信中药饮片公司）；25ml带塞比色管；100ml天波牌容量瓶（A级）；酸式滴定管；试验用水均为超纯水。

2.2 样品测定 称取当归材粉末约1g研磨均匀的试样，精密称定，以少量水润湿并移入100ml容量瓶中，然后加入20ml四氯汞钠吸收液，浸提4h，加入亚铁氰化钾及乙酸锌溶液各2.5ml，最后用水稀释至100ml刻度，过滤后备用。取2.00ml样品处理液于25ml比色管中，加四氯汞钠吸收液至10ml，然后再加入1ml氨基磺酸铵溶液（12g/L）、1.5ml甲醛溶液（2g/L）及1ml盐酸副玫瑰苯胺溶液，摇匀，25℃放置10min，用1cm比色杯，以零管调节零点，于波长559nm处测吸光度。配制不同浓度的二氧化硫标准液，在同等试验条件下测定器吸光度并绘制标准曲线。从标准曲线查得相应的二氧化硫含量（或代入回归方程计算得出二氧化硫的含量）然后进行计算[6-9]。

表1 二氧化硫标准溶液及样品测定结果

3 测量不确定度的评估

3.1 数学模型 根据上述测量过程，二氧化硫含量的数学模型如下式中：X为样品中二氧化硫的含量，μg/g；Ci为第i份样品的样液中二氧化硫的含量，μg；mi为第i份样品质量，g；为测定用样液的体积，ml；V2为样品定容体积，ml，n为测定样品数，n=6。

3.2 不确定度来源的分析 根据数学模型分析，经过对试验整个过程的不确定因素分析，其不确定度可以归纳为5个方面[11-14]：①样液中二氧化硫的含量（C）引入的不确定度u(C)；②质量m引入的不确定度u(m)；③体积V2引入的不确定度u(V2)；④体积V1引入的不确定度u(V1)；⑤平行实验结果(Ci)产生的不确定度u(Ci)。3.3不确定度分量的量化

3.3.1 样液中二氧化硫的含量 （C）引入的不确定度u(C)即标准曲线拟合过程中引入的不确定度u(C)：配制不同浓度的二氧化硫标准溶液，并对吸光度进行测定，测定数据见表1。

由表1拟合曲线得到方程为Y=0.023X+0.015，r=0.9985，取供试品溶液，平行测定2次，由直线方程求得Cpred=15.91μg，则Cpred不确定度u(C)为：u，此公式[15]中：0.0086，其中 S(A)为回归标准差；Ai为标准溶液吸光度测定值；Afi为Ci对应于拟合曲线上的响应值；n为标准曲线制备过程中测定了6个浓度，每个浓度测定2次，n=12；p为每份样品测定次数，p=2；Ci为标准溶液含量测定值为标准溶液测定平均值872μg，Sxx为标准溶液的浓度残差，502.72μg，则供试品合成标准相对不确定Urel(C)=u(C)/Cpred=0.3075/15.91=0.0193。

3.3.5 平行试验结果产生的不确定度u(Ci)平行测定当归药材6次，RSD=4.69%，计算得知当归药材中残留二氧化硫含量的最佳估计值为729.34μg·g-1。由贝塞尔公式求得单次测量标准差s(C2)为：s(Cj)由测量重复性导致的标准不确定度为：u9646μg·g-1。因此，重复测定的相对合成标准不确定度

3.4 计算合成标准不确定度 不确定度分量汇总见表2。

表2 各不确定度分量汇总表

3.5 计算扩展不确定度及报告不确定度 取95%的置信概率，包含因子k=2，则U95=0.02736×729.34×2=39.92μg/g，本次实验含量测定结果可表示为（729.34±39.92）μg/g。

4 讨论

盐酸副玫瑰苯胺法测量当归药材中二氧化硫残留量的过程中，测量结果的标准不确定度为19.96μg/g，在95%的置信概率下，取包含因子k=2，其扩展不确定度为39.92μg/g。样品中二氧化硫含量是 729.34μg/g，其真实含量可表示为(729.34±39.92)μg/g。用传统方法计算其相对误差为5.47%，在允许范围内。

通过不确定度的评定可以看出，本方法测量结果的不确定度主要来自标准曲线拟合，其次来自于样品的重复测定。这跟方法的精密度有关。因此，在测试样品时，必须严格控制实验条件，应尽量使平行样的质量相近，并且操作规范，建议每个样品平行测定次数不小于3次，以减少平行测定引入的不确定度。同时，尽可能使绘制的标准曲线的相关性好。