一种简单、极快的植物叶片DNA提取方法

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(1.宁夏农林科学院 农业生物技术研究中心， 宁夏 银川 750002；2.北方民族大学 生物科学与工程学院， 宁夏 银川750021；3.宁夏农林科学院 枸杞工程技术研究所， 宁夏 银川 750002)

DNA是分子生物学研究的主要对象之一，在植物分子生物学和遗传育种中，基因组DNA的质量好坏是影响其成败的关键因素。人们经常需要提取高质量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组Sourthern 分析、酶切、克隆和测序等分子生物学实验。根据植物的研究对象、研究目的和研究成本等不同，提取基因组DNA 所应用的方法也不同。其中，随着作物分子辅助育种的广泛应用与推广，基因型鉴定是最主要的工作，基因组DNA的提取则是最繁重、最耗时的工作之一。目前提取基因组DNA的方法有： 1) CTAB提取法。此方法多用于禾本科植物基因组DNA的提取，是1987年Doyle最先应用[1],后来应用改进的CTAB法，用特定吸附作用的螯合树脂在特定条件下，吸附、纯化DNA； 2) PVP提取法。此方法主要应用于林木类植物DNA的提取，1997年Kim 最先应用此方法提取果树和针叶类林木中高质量的DNA[2]； 3) SDS提取法。此方法适用于多种植物DNA的提取。 4) 尿素提取法。此方法适用于一般植物和真核微生物DNA的提取，1990年Dudler最先应用此方法[3-5]。这些方法均用到离心机、提取步骤繁杂、配制化学试剂种类众多、提取过程刺激味大，缺乏高效的、快速、环保的提取植物基因DNA的方法。

本研究针对以上基因组DNA提取方法存在的不足进行改进，用时大约90 s即可完成植物叶片基因组DNA的提取，且完全可以满足PCR反应的基因型鉴定[6]、基因克隆和测序等需要。

1 材料与方法

1.1 植物材料

选取4 mg水稻新鲜、幼嫩叶片为试验材料。

1.2 主要试剂

植物细胞裂解液(裂解液中SDS质量百分比浓度为0.06%、 EDTA的浓度为25 mmol/L、NaCl的浓度为250 mmol/L、Tris-base 200 mmol/L， pH=8.0)；DNA漂洗液(Tris-base的浓度为10 mmol/L、Tween-20质量百分比浓度为0.15%)；2×Mixture PCR扩增试剂盒购自北京擎天生物科技有限公司；DNA Marker DL 2000，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、DH 5 α感受态均为北京天根生化科技有限公司产品；Peasy-T载体为北京全式金生物公司产品，其它试剂为分析纯；测序工作由北京擎天生物科技有限公司用ABI 3730测序仪完成。

1.3 引物序列与合成

针对水稻Actin基因设计上下游引物Actin_FPrimer，Actin_RPrimer，预计扩增大小为459 bp。针对水稻BADH2第三外显子片段，扩增片段预计大小为431 bp。

Actin_FPrimer：TGCTATGTACGTCGCCATCCA，

Actin_RPrimer：AATGAGTAACCACGCTCCGTC，

E 3_FP： GGCATATGCGAGCATTTTAT,

E 3_RP：TAGTACCATGCTTGGGTC。

以上引物由上海捷瑞生物公司合成，用去离子水将各引物稀释到10μM工作浓度。

1.4 植物叶片DNA提取

植物叶片DNA按以下步骤提取。

1) 水稻叶片提取材料4 mg，装入圆底EP管中，加1粒直径4 mm的钢珠，将管子浸入液氮中冷却，待彻底冷却后(2～3 min)，快速用振荡研磨仪(频率25次/s，时间30 s)将植物组织打碎。

2) 加入植物细胞裂解液300μL，上下颠倒5～6次，溶液变浑浊，室温下放置待用，即得到植物材料DNA的粗提液。若无液氮，可先用小剪刀将叶片尽可能剪碎装入1.5 mL 尖底EP管中，然后加入500μL 植物细胞裂解液振荡破碎组织。

3) 将干净脱脂棉签浸入步骤二中的DNA的粗提液3 s，将浸润的棉签迅速在DNA 漂洗液中轻轻漂洗3次，然后再将其在100μL 去离子水(ddH2O)或TE彻底洗脱3～5次，洗脱过的ddH2O即DNA溶液，可用于下游的分子生物学实验。

1.5 PCR检测

为了验证所提DNA是否满足PCR扩增，选取水稻肌动蛋白基因Actin设计的上述引物，预计扩增大小为459 bp。按照以下PCR反应体系配置反应液20μL：2×Mixture,10μL；Actin-FPrimer，1μL；Actin-BPrimer，1μL：上述DNA溶液2μL；ddH2O 6μL。反应程序为：预变性95 ℃，5 min；循环30个，95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；最后延伸72 ℃，10 min。PCR产物上样量为10μL，电压120 V，4 CM/V；恒压电泳30～50 min。

1.6 DNA灵敏度检测

为了检测其灵敏度，对所提DNA溶液进行了梯度稀释。首先吸取2μL DNA溶液至8μL 去离子水中，再从稀释溶液中吸取2～8μL 去离子水，依次稀释到107。以上述依次稀释溶液为模板进行PCR扩增。

1.7 DNA测序验证

为了检测此方法所提DNA是否满足克隆、测序的需要，用E 3_FP，E 3_RP引物对水稻OsBADH2基因的片段进行扩增，预计扩增大小为431 bp，用胶回收试剂盒将其回收，然后连接Peasy-T载体，转化DH 5 α感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆进行测序分析。胶回收步骤、连接体系、转化方法和质粒提取均按试剂盒说明书进行。

2 结果与分析

2.1 植物叶片DNA提取

依据以上的提取方法，得到DNA粗提液效果见图1。圆底EP管中，溶液呈翠绿色，植物组匀浆彻底，表明使用液氮效果较好。所得DNA溶液为Ⅰ。无液氮提取效果见图2。此方法得到的DNA粗提溶液较前法较淡，一些叶片组织明显未被破碎。但通过延长破碎时间改善组织破碎效果。所得到DNA溶液为Ⅱ。

图1 液氮研磨效果

图2 无液氮研磨效果

2.2 PCR产物凝胶电泳结果

液氮研磨法和无液氮研磨法2种提取方法，分别用水稻Actin基因的上述引物进行了PCR，其产物的凝胶电泳分别见图3和图4。两图中均有459 bp条带扩增，说明2种方法所提DNA溶液满足基因扩增的需要。

图3 液氮研磨法PCR扩增

图4 无液氮研磨法PCR扩增

2.3 DNA溶液的灵敏度检测

以液氮方法提取的DNA溶液梯度稀释后作为模板，以水稻Actin基因设计的引物进行扩增，PCR产物凝胶电泳见图5，从左到右稀释倍数依次递增。图中结果表明，此方法提取的DNA溶液1 000万倍稀释，依然可以进行目的基因的PCR扩增。

图5 DNA溶液灵敏度验证

2.4 目标基因的测序分析

以E 3_FP，E 3_RP引物对水稻OsBADH2基因的片段扩增结果见图6，扩增片段大小为431 bp；阳性克隆质粒的测序结果见图7。测序峰图清晰，经比对完全与参考序列一致，此方法所提DNA完全满足基因克隆、测序的需要。

图6 OsBADH2 PCR 扩增

图7 BADH2测序图

3 结 论

本研究以水稻幼苗叶片为试验材料，通过棉签等吸附材料直接提取DNA，建立了一种简便、快速的DNA提取方法，大大加快了分子标记辅助育种中基因型鉴定等繁锁工作。同时，该方法对其它植物，如花生[28]，铁皮石斛[29]、青稞[30]、燕麦[31]、南瓜[32]等叶片DNA提取有参考价值。

4 讨 论

由于植物特有的细胞壁及胞内物质，很难轻易从植物中分离高产量和高质量的DNA[6]。在选取材料时，应尽可能的挑取处于生长旺盛期的幼嫩组织。这时组织中蛋白质、多糖及酚类化合物都很少，并且由于细胞多数处于分裂旺盛期，DNA的产量也会很高，几乎所有的实验手册都推荐以幼嫩组织作为提取基因组DNA的首选材料[8-10]。叶片是十分理想的材料，叶片中维管组织含量少，提取效果较好。本试验中，选用4 mg新鲜、幼嫩水稻叶片为材料。通过组织破碎，发现叶片量不是越多越好，材料量适合，组织破碎均匀。圆底EP管较尖底EP管效果好，钢珠在破碎仪作用下，更能够在狭小的空间中将叶片组织破碎。漂洗液中Tween 20的作用主要是清洗杂质。SDS是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜上的脂质与蛋白质，从而破坏细胞膜结构；且能解聚细胞中的核蛋白，使蛋白质变性而沉淀下来。增大提取缓冲液中SDS的含量,有助于去除糖类和酚类物质[11-14]。本实验中，没有使用RNAase I去除DNA溶液中的RNA，这对基于PCR的基因型鉴定没有影响。本试验中的棉签可以用滤纸等具有吸附作用的材料代替，作者用少量Whatman G/A 玻璃纤维滤纸固定在牙签头上，使用本方法提取步骤同样获得可以直接用于PCR扩增的DNA。对于提取其他植物叶片组织或者其它组织DNA及其下游基因克隆等分子生物学操作，同样可以借鉴本方法[15-27]。