白术同源四倍体扩繁移栽试验

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(1.贵州师范学院化学与生命科学学院， 贵阳 550018；2.贵州省生物资源开发利用特色重点实验室， 贵阳 550018)

白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz)属菊科多年生草本[1]，以根茎入药，为我国常用特产药材之一，主产湖南、安徽等地。近现代药理研究表明：白术主要含内酯类化合物、多糖和挥发油[2]。大量研究证明，白术对子宫平滑肌、调节免疫、调节胃肠功能、抗衰老、利尿、扩张血管、抗炎、抑菌、镇静、降血糖等有重要作用[3-4]。

目前我国白术的栽培现状并不乐观，白术人工栽培品种退化、产量低下，药材品质渐差，有效成分含量不稳定，无法满足市场的需求。多倍体具有抗逆性强、巨型性、药用有效成分提高等特点[5-6]。药用植物多倍体诱导技术发展很快，取得了一定的成就，国内采用人工多倍体诱导技术培育出的中药多倍体新品种有当归、党参、菘蓝、百合、牛膝、枸杞等30多个，多倍体育种逐渐成为药用植物育种的最重要方法之一。国外对白术研究较少，外国学者多研究白术挥发油或对白术体内的某些物质的鉴定等[7-8]。国内对白术的研究主要集中在白术的快繁技术[9]，栽培和管理[10]，药理作用和化学成分[11]以及同源四倍体诱导鉴定[12]等方面。周日宝等[12]对白术同源四倍体株系的繁育进行过研究，但未见对白术四倍体扩繁移栽方面的相关报道。通过探索白术四倍体的最佳扩繁培养基及适宜移栽条件，为进一步开发和利用白术及白术新品种选育提供一定参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器和试剂

1.1.1 供试材料

白术试管中间繁殖材料保存于贵州特色生物资源开发利用重点实验室，经倍性鉴定后可作为扩繁及移栽试验材料。

1.1.2 主要仪器

立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50 KB)，上海申安医疗器械厂；光照培养箱(GZX-250)，天津市泰斯特仪器有限公司；双人单面净化工作台(SW-CJ-2 FD)，苏州净化设备有限公司；实验室pH计(pHSJ-3 F)，上海雷磁仪器厂。其他仪器均为一般常规仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 白术试管苗倍数鉴定

1) 解剖学鉴定：为进一步确定白术试管苗的染色体倍性，于晴天09：00时气孔张开时，取植株上的功能叶片3～5片，置于卡诺氏固定溶液中(无水乙醇∶冰乙酸∶氯仿=6∶1∶3)固定2～3 h；待叶片褪色后放入蒸馏水中浸泡3～5 min，然后撕下下表皮置于载玻片上展平，滴上1%的I-KI溶液，制成临时装片，观察气孔大小、分布及叶绿体数目，计数，筛选区分四倍体苗。

2) 细胞学鉴定：将经解剖学鉴定后根长为1～2cm的白术试管苗参照聂杨眉和向增旭等[13-14]的方法，分别将其根尖切下，放入浓度为0.002 mol/L的8-羟基喹啉溶液中进行预处理，温度为10～20 ℃；处理4 h后，洗干净放入卡诺氏固定液中固定24 h；固定好后用蒸馏水洗净放入0.075 mol/L KCl溶液中低渗20～30 min，再放入0.2 mol/L HCl溶液中解离5～10 min，温度为60 ℃；解离后浸泡在蒸馏水中，低渗30 min；处理完后，将根尖制成临时装片用显微镜观察，统计染色体数量。

注：a为白术二倍体植株的气孔大小及分布(10×10)；b为白术四倍体植株的气孔大小及分布(10×10)；c为白术二倍体植株的叶绿体(4×10)；d为白术二倍体植株的叶绿体(4×10)。图1 白术二倍体和四倍体植株气孔与保卫细胞的比较

1.2.2 白术试管苗增殖培养

(1)系统产生(0,1)内的随机数rv,如果粒子的变异概率pvi大于rv,则发生变异,其中pvi如式(7)所示。

将以鉴定后的白术二倍体、四倍体试管苗诱导的丛生芽苗切成带有2～3个芽的小芽团，立即接种到添加不同浓度生长调节剂的增殖培养基培养。供试增殖培养基配方：NAA浓度为0.2 mg/L，6-BA浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L。每周观察记录增殖生长情况，筛选最适增殖培养基。

1.2.3 白术试管苗生根培养

选择经扩繁茎比较粗，叶片厚且深绿的健壮二倍体试管芽苗及同源四倍体芽苗进行生根培养：将无根芽苗接种于1/2 MS+0.5 mg/L NAA的生根培养基里培养。

1.2.4 白术试管苗移栽

选择长势一致的根长为2～3 cm的白术试管苗，将其分别移栽到经高锰酸钾+甲醛熏蒸处理过的珍珠岩+蛭石(1∶1)、细沙+园土(2∶1)、园土+碳渣(2∶1)含水量为75%～85%的基质中，及基质含水量分别为85%～95%、75%～85%、65%～75%的园土+碳渣(2∶1)基质中。观察记录白术试管苗的成活率和长势，筛选最佳移栽基质及移栽基质含水量。

1.3 培养条件及移栽条件

培养基pH值：5.8～6.0；培养温度：(25±1)℃；光照时间：16 h/d；相对湿度：35%～60%，光照度：1 500～2 000 lx。

2 结果与分析

2.1 白术试管苗倍性鉴定

2.1.1 白术二倍体和四倍体的气孔大小和叶绿体数量

由表1可以看出，白术二倍体植株叶片气孔个数是四倍体植株的2.7倍；白术四倍体植株的保卫细胞叶绿体数目是二倍体植株的1.9倍；白术四倍体植株的气孔明显大于二倍体植株的气孔，但其气孔分布较少，见图1。

表1 白术二倍体和四倍体植株的气孔数目与叶绿体数目比较

植株类型平均每视野气孔数(个)平均每气孔叶绿体数(个)二倍体植株11415四倍体植株4328

在显微镜下观察根尖制成的临时装片结果为：白术二倍体植株的染色体条数为2 n=2 x=24，四倍体植株的染色体条数为2 n=2 x=48，见图2。

2.2 生长调节剂对白术试管苗增殖培养的影响

接种在增殖培养基中培养的小芽团，增殖情况见表2，由表2可知：小芽团接种在不同浓度配比的培养基上，其增殖率不同：在NAA浓度不变的条件下，随着6-BA的浓度增高增殖倍数增加，当6-BA浓度超过1.5 mg/L时增殖倍数降低。此外，在不同激素配比的增殖培养基中小芽团的增殖周期均为30 d，且在6-BA浓度为1.0～2.0 mg/L之间，芽苗色绿，生长健壮，可见在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的培养基上增殖效果较佳。

2.3 移栽条件对白术试管苗移栽的影响

2.3.1 不同基质配比对白术试管苗移栽的影响

移栽到不同配比相同含水量的基质中，二倍体、四倍体试管苗的成活率和生长情况见表3。由表3可知：基质配比为园土+碳渣(2∶1)的移栽条件下，白术试管苗的成活率最高，为34.72%，在该基质配比下苗绿，茎较粗壮，根系较发达，长势最佳。

2.3.2不同基质含水量对白术试管苗移栽的影响

由表4可知，移栽到相同配比不同含水量基质中的二倍体、四倍体试管苗成活率和生长情况：基质含水量为75%～85%的移栽条件下，试管苗的成活率最高，为44.44%，在该基质含水量下苗的长势也最佳。

图2 白术二倍体与四倍体植株染色体的比较

表2 不同生长调节剂配比对白术试管苗增殖的影响

激素配比(mg/L)接种芽数(个)增殖芽数(个)增殖倍数增殖周期(d)芽苗长势6-BA0.5+NAA0.23103.3330苗绿,生长较健壮,增殖芽量略少6-BA1.0+NAA0.23237.6730苗绿,生长健壮,增殖芽量较多6-BA1.5+NAA0.23175.6730苗绿,生长健壮,增殖芽量较多6-BA2.0+NAA0.23124.0030苗绿,生长健壮,增殖芽量多

表3 不同基质配比对白术试管苗移栽的影响

处理基质配比移栽数(株)成活数(株)成活率(%)苗的长势1珍珠岩+蛭石(1∶1)722331.94苗绿,茎粗壮,根系发达2细沙+园土(2∶1)721419.44苗绿,茎较细,根系不发达3园土+碳渣(2∶1)722534.72苗绿,茎较粗壮,根系较发达

表4 不同基质含水量对白术试管苗移栽的影响

处理含水量(%)移栽数(株)成活数(株)成活率(%)苗的长势185%～95%721622.22苗绿,茎粗壮,根系发达275%～85%723244.44苗绿,茎较粗壮,根系较发达365%～75%721419.44苗绿,茎较细,根系不发达

表5 相同移栽条件对白术二、四倍体试管苗移栽的影响

植株类型移栽条件移栽数(株)成活数(株)成活率(%)苗的长势二倍体苗园土+碳渣(2∶1)含水量75%～85%241354.17苗绿,茎粗壮,根系发达四倍体苗园土+碳渣(2∶1)含水量75%～85%241666.67苗绿,茎较粗壮,根系较发达

2.3.3相同移栽条件对白术二倍体、四倍体试管苗移栽的影响

移栽到相同配比及含水量基质中的二倍体、四倍体试管苗生长情况和成活率见表5。由表5可知：在基质配比为园土+碳渣(2∶1)、基质含水量为75%～85%的移栽条件下，白术二倍体试管苗的成活率为54.17%，白术四倍体试管苗的成活率为66.67%，且白术四倍体苗的长势优于白术二倍体苗。

3 结果与讨论

3.1经本实验鉴定后发现：白术二倍体植株平均每视野的气孔数目是四倍体植株气孔数目的2.7倍，但其气孔要小于四倍体植株的气孔；白术四倍体植株平均每气孔的叶绿体数量是二倍体植株叶绿体数量的1.9倍，但其叶绿体体积小于二倍体植株的叶绿体；白术四倍体植株的染色体数目为48条，二倍体植株的染色体数目为24条。

3.2本实验设置了生长调节剂6-BA与NAA的不同浓度配比，发现不同浓度的6-BA对白术增殖有明显的影响：6-BA的浓度过高或过低都会使白术增值率降低，当6-BA的浓度为1.0 mg/L时，白术的增值率最大，增殖倍数为7.67，且苗的长势最佳，即白术最适扩繁培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

3.3本实验设置了不同的基质配比、基质含水量的移栽条件，将白术试管苗分别在不同的移栽条件下进行移栽生长，发现不同移栽条件对白术试管苗的成活率有明显影响：基质配比为园土+碳渣(2∶1)的基质中，白术试管苗的成活率最高，为34.72%；基质含水量为75%～85%的基质中，白术试管苗的成活率最高，为44.44%。

3.4在基质配比为园土+碳渣(2∶1)、基质含水量为75%～85%的移栽条件下，四倍体试管苗的成活率为66.67%，二倍体试管苗的成活率为54.17%，白术四倍体试管苗的成活率高于二倍体试管苗的成活率12.50%，且四倍体苗的长势较好。

3.5在本实验移栽条件下，白术二倍体试管苗和四倍体试管苗的成活率均较低，使四倍体株系的繁育受到一定的影响，有待进一步优化移栽条件提高移栽成活率。