柠檬苦素对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎的治疗作用及机制

王亚军，陆 颖，周艳芬，王 宇，郭素菡，张 琪，孙 阳

(南京工业大学 药学院，江苏 南京 211800)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)通常指溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)，主要表现为肠道的慢性非特异性炎症[1]。现代医学研究尚未弄清其病因。目前，在我国UC的发病率呈不断升高趋势[2]。由于此病反复发作，患者通常一生难以摆脱药物。针对UC的治疗，以5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂为主，但由于其副作用或因药物价格昂贵，给患者造成极大的心理、生理以及经济负担，这些药物的临床应用受限[3]。因此，寻找安全高效的治疗药物具有重要意义。

中药或天然产物因安全、副作用小，一直是当前UC研究的热点。中药陈皮、枳壳、吴茱萸及白鲜皮等对炎症性肠病有较好的治疗作用，其提取物主要成分之一柠檬苦素具有良好的抗炎、抗肿瘤、镇痛、抗氧化及抗病毒等作用[4]。柠檬苦素是一种存在于芸香科(Rutaceae)和楝科(Meliaceae)植物中的三萜类(triterpenoids)化合物，是重要的具有高生物活性的次生代谢产物[5]。Matsuda等[6]报道了从吴茱萸(芸香料)中分离出的柠檬苦素具有明显的抗炎镇痛作用。Tanaka等[7]报道柑橘中柠檬苦素、奥巴叩酮对氧化偶氮甲烷(AOM)诱导雄性鼠结肠肿瘤发生的抑制作用。Berhow等[8]等和Pati等[9]的试验证明,柑橘类柠檬苦素对人体不存在毒副作用。刘明浩等[10]实验表明，柠檬苦素对于三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)诱导的炎症性肠病大鼠有明显的治疗作用。

葡聚糖硫酸钠(DSS)是一种高分子的硫酸多聚糖，DSS通过抑制DNA合成，破坏肠黏膜屏障，使肠道菌群失调，肠道抗原进入黏膜层，导致继发性炎症反应[11]。本实验建立30 g/L DSS诱导小鼠急性溃疡性结肠炎模型[12]，通过给予柠檬苦素灌胃治疗，并以目前市面上销售的治疗溃疡性结肠炎药物5-氨基水杨酸做对照，观察结肠炎小鼠的一般情况、结肠长度和病理损伤程度，研究结肠组织细胞胞浆和细胞核中NF-κB的表达变化，探讨柠檬苦素对于小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂

柠檬苦素(批号:K120301)，西安开来生物工程有限公司；葡聚糖硫酸钠 (DSS，分子量为(3.6～5.0)×104，批号:160110)，MP Biomedicals公司; 5-氨基水杨酸(5-ASA，批号:A129982)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，批号：20120928)，国药集团化学试剂有限公司；兔抗小鼠NF-κB p65、β-actin、Histone一抗 、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗，美国 Santa Cruz公司；核蛋白和浆蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒、ECL化学发光液，碧云天生物技术研究所。

1.2 实验动物及饲养

C57BL/6小鼠(18～22 g、7～8 周龄、雌性)，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，合格证号为SCXK(苏)2017-0001。

全价营养颗粒饲料，江苏省协同医药生物技术有限公司。

饲养条件，室温(20±2)℃，湿度55%～65%，明暗交替，光照适度，通风洁净良好。

1.3 DSS诱导的小鼠UC造模方法

C57BL/6小鼠适应性饲养7 d后，给予3% DSS连续饮用7 d后，继续饮用正常水3 d，建立小鼠急性UC模型。

1.4 小鼠分组及实验方法

C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、模型组、柠檬苦素组(limonin)和5-氨基水杨酸组(5-ASA)，每组5只。采用上述方法造模，各治疗组给予相应药物，柠檬苦素组给药剂量为50 mg/(kg·d)，5-ASA组给药剂量为50 mg/(kg·d)，而模型组给予相同剂量的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，每日1次，连续灌胃10 d直至实验结束。正常组小鼠，每天给予正常水喂养。每天记录各组小鼠体质量。

治疗结束后，小鼠麻醉，摘眼球取血。处死所有小鼠，剖开腹腔暴露全结肠，纵向切开，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗干净，平铺于白纸上，观察各组小鼠结肠黏膜损伤情况。取部分结肠，40 g/mL多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察并评估肠黏膜损伤情况，进行组织学评分。另取部分结肠进行蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测蛋白NF-κB p65的相对表达量。

1.5 检测及评估指标

1.5.1 小鼠体质量记录

观察小鼠每日的食量、饮水量、体质量、精神状态及有无死亡等情况，并做好记录。

1.5.2 结肠组织学病理学分析

采用50倍放大镜观察小鼠结肠黏膜的大体形态，有无溃疡、糜烂、出血点和充血等情况。通过组织病理学检查，进一步观察肠黏膜有无水肿、充血、糜烂、溃疡及隐窝脓肿，炎性细胞浸润等改变。

1.5.3 Western blotting法检测蛋白NF-κB p65的表达

称取小鼠冷冻肠组织，匀浆机低温匀浆，提取组织总蛋白后，BCA法检测蛋白定量。给予10%SDS-PAGE凝胶电泳，然后转膜、封闭，加NF-κB p65 抗体用化学发光法显影，定影，图像处理软件读取灰度值并计算目的蛋白相对表达量。

1.6 统计学处理

2 结果与讨论

2.1 柠檬苦素对结肠炎小鼠体质量的影响

正常组小鼠体质量增加、饮食、饮水、活动度及大便均正常。考察柠檬苦素对结肠炎小鼠体质量的影响，结果见图1。

由图1可知：各造模组小鼠在给予DSS后，体质量开始下降；同时模型组小鼠在给予DSS 3 d后大便开始变稀，病情逐渐增加，并且出现不同程度的便血、体质量明显减轻、懒动、厌食及毛发干枯等表现，说明造模成功[13-14]。与DSS组小鼠体质量降低相比，柠檬苦素组小鼠体质量开始逐渐回升，说明柠檬苦素可以缓解DSS诱导结肠炎小鼠的临床症状，与模型组相比，这些指标(进食、体质量和活动度)都有一定好转。这表明柠檬苦素对于DSS诱导的小鼠结肠炎有良好的治疗作用。

n=5, #表示P<0.05，##表示P<0.01，与空白组相比；*表示P<0.05，**表示P<0.01，与DSS模型组相比图1 柠檬苦素对结肠炎小鼠体质量的影响Fig.1 Effects of limonin on body weight

UC是一种以腹泻、腹痛、黏液脓血便为主要临床表现的非特异性慢性炎症性疾病。病理组织学检测可见结肠黏膜炎症性损伤，黏膜充血水肿、糜烂，溃疡形成，大量炎性细胞浸润[15]。DSS通过抑制DNA合成，破坏肠黏膜屏障，使肠道菌群失调，肠道抗原进入黏膜层，导致继发性炎症反应。同时，肠道吞噬细胞清除细菌产物的功能被削弱，使肠道炎症持续存在，引发严重的腹泻、便血等 IBD 相关症状[16]。本研究中建立DSS诱导的结肠炎小鼠模型，发现柠檬苦素可以缓解DSS诱导结肠炎小鼠的临床病症，说明柠檬苦素具有潜力用于结肠炎的治疗。

2.2 柠檬苦素对结肠炎小鼠结肠长度的影响

取各组小鼠完整结肠，考察柠檬苦素对结肠炎小鼠结肠长度的影响，结果如图2所示。

(b)数据分析n=5,#表示P<0.05，##表示P<0.01，与空白组相比；*表示P<0.05，**表示P<0.01，与 DSS模型组相比图2 柠檬苦素对结肠炎小鼠结肠长度的影响Fig.2 Effects of limonin on colon length in mice

由图2可知：与空白对照组相比，患有结肠炎的小鼠的结肠明显缩短，而柠檬苦素给药组小鼠与DSS组小鼠相比，结肠长度显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)，结肠长度恢复至近正常水平。结肠炎发生时，伴有结肠组织水肿，导致结肠长度缩短。柠檬苦素能增加DSS诱导结肠炎小鼠的结肠长度，表明柠檬苦素能够改善结肠组织炎性水肿，有效治疗DSS诱导的小鼠结肠炎。

2.3 柠檬苦素对结肠炎小鼠结肠黏膜损伤的影响

通过小鼠结肠HE染色病理分析，考察柠檬苦素对结肠炎小鼠结肠黏膜损伤的影响，结果如图3所示。由图3可知：模型组小鼠与空白对照组相比，小鼠结肠黏膜层有中度或重度炎细胞浸润，局部有轻度或重度坏死，坏死处已有成纤维细胞增生，黏膜下层出现水肿和炎症细胞浸润；50 mg/(kg·d) 柠檬苦素组小鼠结肠黏膜结构基本恢复正常，上皮结构较完整，几乎没有炎症细胞浸润。5-ASA组小鼠结肠组织的病理损伤也有一定程度的改善，但没有相同剂量的柠檬苦素效果好。结果表明：柠檬苦素能够减轻DSS诱导的结肠黏膜损伤，抑制炎症细胞浸润，从而改善DSS诱导的结肠炎症病变。

图3 柠檬苦素对DSS诱导小鼠结肠炎病理损伤的影响Fig.3 Effects of limonin on DSS-induced colon pathological damage in mice

2.4 柠檬苦素对结肠炎小鼠结肠组织NF-κB核转位的影响

核转录因子kappa B(NF-κB)是UC发病时肠道内众多免疫和炎症反应相关基因诱导表达的关键调控因子[17]，是一类能与多种免疫球蛋白轻链基因启动子κB 序列(5′-GGGACTTTCC-3′)特异性结合并促进转录的蛋白质总称，其可以将信息从胞浆传递至细胞核内诱导相关基因的表达[18]，通过调节多种促炎介质基因的表达[19-20]，在肠道炎症反应中起枢纽作用。虽然 UC 的发病机制尚未清楚，但是NF-κB p65蛋白介导的信号通路在UC发生、发展中的作用十分重要，已成为治疗UC潜在的作用靶点。

因此，考察柠檬苦素对结肠炎小鼠结肠组织核转录因子kappa B(NF-κB)核转位的影响，结果如图4～5所示。

n=5,#表示P<0.05，##表示P<0.01，与空白组相比；*表示P<0.05，**表示P<0.01，与DSS模型组相比图4 柠檬苦素对结肠炎小鼠结肠细胞浆蛋白 NF-κB的影响Fig.4 Effects of limonin on the protein expression of cytoplasmic NF-κB in colon tissues of mice

n=5,#表示P<0.05，##表示P<0.01，与空白组相比；*表示P<0.05，**表示P<0.01，与 DSS模型组相比图5 柠檬苦素对结肠炎小鼠结肠细胞核蛋白 NF-κB的影响Fig.5 Effects of limonin on the protein expression of nuclear NF-κB in colon tissues of mice

由图4～5可知：模型组小鼠结肠组织细胞胞浆中NF-κB p65蛋白相对表达量显著低于正常组，具有显著性差异；而柠檬苦素组小鼠结肠组织细胞浆中NF-κB p65蛋白水平显著高于模型组，且差异具有统计学意义(P<0.01)。5-ASA组小鼠结肠组织细胞浆中NF-κB p65蛋白水平也高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

模型组小鼠结肠组织细胞核中NF-κB p65蛋白相对表达量显著高于正常组，具有显著性差异(P<0.01)。而柠檬苦素组小鼠结肠组织细胞核中NF-κB p65蛋白水平显著低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.01)。5-ASA组小鼠结肠组织细胞浆中NF-κB p65蛋白水平也低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

结果表明，柠檬苦素可以通过抑制NF-κB p65蛋白的核转位，抑制其活化，进一步减少相关促炎细胞因子的分泌，从而减轻炎症反应。

3 结论

利用DSS构建小鼠溃疡性结肠炎模型，并选用柠檬苦素作为治疗药物，深入研究了柠檬苦素对DSS诱导的小鼠肠炎的抑制作用及其作用机制。结果表明，柠檬苦素作为一种天然化合物，对实验小鼠的临床症状及结肠黏膜的损伤有显著的改善作用。作用机制结果显示，柠檬苦素可能通过抑制细胞中NF-κB p65蛋白的核转位，抑制其活化，下调促炎细胞因子的分泌，从而治疗结肠炎。因此，本研究为柠檬苦素作为治疗结肠炎药物的开发和利用提供了理论基础。