果胶酶澄清血橙汁的工艺研究

文英杰，王诗隆，李林辉

（西华师范大学生命科学学院，四川南充 637009）

血橙属混种植物，首次出现在1850年的欧洲，中国主要分布在四川等地，其中四川资中被称为“塔罗科血橙之乡”。血橙具有促进血液循环、促进皮肤细胞再生的药用价值。红玉血橙在我国广泛的栽培，果肉多汁细嫩并且具有玫瑰花香味[1]。塔罗科血橙是从塔罗科血橙珠心系后代中选育而成，塔罗科血橙含有丰富的VE及其他多酚化合物，具抗氧化、防止心血管疾病和抑制癌症发生等生理作用[2-3]。然而，血橙的上市时间短暂且不耐贮存，不能周年供应，可以把它加工成果汁饮品、浓缩汁等，其中利用橙汁酿酒也是一种有效的解决办法，而在橙子酒酿制过程中澄清工艺是关键环节[4]。在血橙加工过程中，为了提高果汁出汁率、降低果汁黏稠度等需要加入果胶酶。在上世纪30年代初，国外就将果胶酶应用于工业生产中，经过半个多世纪的发展，果胶酶已经实现商品化[5]。近年来，蒲海燕等人[6]不仅利用果胶酶对雪莲果汁澄清效果的影响进行了研究，用果胶酶对芦荟汁[7]、香蕉汁[8]、布朗李汁[9]等果汁饮料的澄清处理，但对于果胶酶澄清血橙的研究较少。其中，牛丽影等人[10]利用果胶酶对5个不同品种的橙汁进行酶解处理，结果表明5个品种（哈姆林、橘橙、凤梨甜橙、锦橙、特罗维他）酶解后的澄清度分别为28.35%，26.64%，16.46%，34.96%，9.12%。研究人员利用果胶酶针对玫瑰香橙汁选出了适宜的生产工艺，在此适宜的工艺条件下，玫瑰香橙汁的透光率为98%。而试验选用的这2种不同品种的血橙是由于塔罗科血橙市场潜力大，市场份额大，红玉血橙成熟期晚，能调节市场供应[1]。

在对2个不同品种的血橙汁进行预处理的基础上，添加果胶酶对橙汁进行澄清处理，主要目的是探究并确定血橙汁的澄清工艺参数，从而为后续酿酒工业提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

红玉血橙、塔罗科血橙，均购于南充市；果胶酶制剂LALLZYME EX-V，购于上海康禧食品饮业有限公司；钾片、柠檬酸，均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 血橙汁的制备

挑选血橙并清洗干净，然后放入沸水中漂烫2 min，再用简易榨汁机榨汁，经干净纱布过滤盛于烧杯中备用。

1.2.2 果胶酶澄清橙汁的单因素条件

（1）果胶酶澄清橙汁的单因素试验。取刚榨出的新鲜红玉血橙、塔罗科血橙橙汁，分别装于6支150 mm×15 mm的试管中，每支试管装入橙汁10 mL，加入果胶酶使其质量浓度分别为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06 g/L的果胶酶，于40℃条件下水浴反应60 min。取出后取上清液以转速5 000 r/min离心5 min，于波长680 nm处测定透光率，透光率越大者表示果汁的澄清度越高，以此确定果胶酶最适用量。每个质量浓度设定3个重复，最终选取平均值。

（2）酶解温度对澄清效果的影响。取刚榨出的新鲜红玉血橙、塔罗科血橙橙汁，分别装于6支150 mm×15 mm的试管中，每支试管装入橙汁10 mL，分别加入0.02 g/L（塔罗科血橙为0.05 g/L）果胶酶，在20，30，40，50，60，70℃下水浴反应60 min，取出后取上清液以转速5 000 r/min离心5 min，于波长680 nm处测定透光率，同时确定果胶酶最适酶解温度。每个酶解温度设定3个重复，最终选取平均值。

（3）酶解时间对澄清效果的影响。取刚榨出的新鲜红玉血橙、塔罗科血橙橙汁，分别装于8支150 mm×15 mm的试管中，每支试管装入橙汁10 mL，分别加入0.02 g/L（塔罗科血橙为0.05 g/L）果胶酶，准备好的8支试管分别在40℃的水浴中反应15，30，45，60，75，90，105，120 min，取出后取上清液以转速5 000 r/min离心5 min，于波长680 nm处测定透光率，同上确定果胶酶最适酶解时间。每个酶解时间设定3个重复，最终选取平均值。

1.2.3 响应面试验设计

（1）多因素试验。选取单因素试验时，得到的较佳酶质量浓度和较佳的作用温度各3个，以取上述榨出果汁为原料，以确定果胶酶处理橙汁的最佳酶质量浓度和温度组合，澄清试验时间依然为60 min，取上清液以转速5 000 r/min离心5 min，测定OD680，同上确定果胶酶的最优参数。上述澄清试验均做3次平行试验。

（2）优化果胶酶澄清工艺试验。根据影响橙汁澄清效果的果胶酶用量、酶解温度、酶解时间3个因子的水平范围，设计出17组三因素三水平的响应面试验，在表1，表2中分别列出了3个因素的水平及编码。上述澄清试验均做3次平行试验。

Box-Behnken设计试验因素和水平设计（红玉血橙）见表1，Box-Behnken设计试验因素和水平设计（塔罗科血橙） 见表2。

1.3 果汁澄清度的测定采用分光光度法

表1 Box-Behnken设计试验因素和水平设计（红玉血橙）

表2 Box-Behnken设计试验因素和水平设计（塔罗科血橙）

澄清的上清液离心后，皇波长680 nm处测定果汁的透光率T（%），透光率越大表示果汁的澄清度越高。

2 结果与分析

2.1 果胶酶用量的影响

果胶酶用量与透光率的关系见图1。

由图1可知，随着果胶酶用量从0.01 g/L升高到0.02 g/L，血橙汁的透光率逐渐升高，由90.2%升高到97.4%，此时达到了最大的透光率。但随着果胶酶的用量从0.02 g/L逐渐增加到0.06 g/L，血橙汁的透光率呈现逐渐下降的趋势，由97.4%减少到95.1%。而塔罗科血橙的透光率变化为在40℃条件下不同果胶酶量酶解60 min塔罗科血橙汁透光率的变化。透光率随着果胶酶用量的增加先上升后下降；当果胶酶用量为0.05 g/L时，透光率达到94.7%。

2.2 酶解温度的影响

酶解温度与透光率的关系见图2。

由图2可知，在不同酶解温度下，0.02 g/L果胶酶用量酶解1 h后红玉血橙汁与塔罗科血橙汁透光率的变化。红玉血橙随着酶解温度由20℃升高到40℃，透光率也从93.8%升高到96.2%，并在酶解温度为40℃时透光度达到96.2%这一最大值。当酶解温度由40℃逐渐再升高并达到70℃时，透光率整体呈现下降趋势。而塔罗科血橙在不同的酶解温度下果胶酶用量为0.02%，酶解时间60 min时塔罗科血橙汁透光率的变化。增加酶解温度从20℃到40℃，橙汁的透光率从91.4%升高到93.2%，当酶解温度为40℃时透光度达到93.2%最大值。

2.3 酶解时间的影响

酶解时间与透光率的关系见图3。

由图3可知，在40℃温度条件下果胶酶用量为0.02 g/L时，不同酶解时间段内红玉血橙汁和塔罗科血橙汁透光率的变化。透光率在整体上呈现升高的趋势，但是在酶解时间达到105 min时，透光率最大为96.3%，之后随着酶解时间的增加，透光率反而有所降低。而塔罗科血橙在40℃酶解温度条件下果胶酶用量为0.05 g/L时，不同酶解时间段塔罗科血橙汁透光率的变化情况。增加酶解时间15～30 min，透光率急速增加，达到最大值90.2%，当酶解时间由30 min逐渐增加到120 min，透光率开始减小。

2.4 优化酶法澄清红玉血橙汁工艺的试验

在所获得的因素的水平范围内，采用三因素三水平响应面的方法设计优化试验。

试验设计方案及结果见表3。

由表3可知，红玉血橙汁的最佳工艺为果胶酶用量0.02 g/L，酶解温度50℃，酶解时间90 min。

回归模型方差分析见表4，回归模型系数的显著性检验见表5。

由表4，表5可知，回归方程及模型p=0.003 5＜0.01，表明模型的拟合程度较好；失拟项p=0.130 1＞0.05，差异不显著，表明试验误差较小；模型的决定系数R2=0.836 9，模型调整决定系数R2Adj=0.627 3，拟合度较好，模型能够反映响应值变化，试验误差小。表7还可以看出，根据系数估计值A（1.95），B（0.76），C（0.037），可知影响因子对响应值的影响程度主效应顺序为A＞B＞C。

表3 试验设计方案及结果

表4 回归模型方差分析

表5 回归模型系数的显著性检验

式中变量为编码值。

2.5 优化酶法澄清塔罗科血橙汁工艺的试验

在所获得的塔罗科血橙的因素水平范围内，采用三因素三水平响应面方法设计优化试验。

试验设计方案及结果见表6。

由表6可知，塔罗科血橙汁的最佳工艺为果胶酶用量0.05 g/L，酶解温度30℃，酶解时间45 min。

表6 试验设计方案及结果

回归模型方差分析见表7，回归模型系数的显著性检验见表8。

由表7，表8可知，回归方程及模型p=0.016 2＜0.05，表明模型的拟合程度较好；失拟项p=0.409 9＞0.05，差异不显著，表明试验误差较小；模型的决定系数R2=0.886 8，模型调整决定系数R2Adj=0.741 3，拟合度好，模型能够反映响应值变化，试验误差小。表10还可以看出，根据系数估计值A（-0.12），B（0.18），C（1.05），可知影响因子对响应值的影响程度主效应顺序为 C′＞B′＞A′。

表7 回归模型方差分析

表8 回归模型系数的显著性检验

注：**表示影响极显著，*表示显著。

果胶酶用量、酶解温度、酶解时间对橙汁透光率的影响见图4。

通过Design Expert 8.0.6软件得到响应曲面图和等高线。在响应面图中圆形等高线表示参数之间交互作用不显著，而椭圆形或马鞍形等高线则表示参数之间交互性较强。

由图（a）、（b） 左图可知，果胶酶用量与酶解温度的交互作用比果胶酶用量与酶解时间的交互作用显著。图（a）中当酶解时间为60 min时，随着果胶酶用量和酶解温度的增加，透光率升高。图（b）中当酶解温度为40℃时，随着果胶酶用量和酶解时间的增加，透光率呈先上升后下降的趋势。图（c）中酶解温度和酶解时间交互作用显著，果胶酶用量为0.02 g/L时，酶解温度低时，酶解时间影响不大，酶解温度高时，酶解时间越长透光率越小；酶解时间短时，酶解温度越高透光率越大，酶解时间长时，酶解温度越高透光率越小。

由图（a） 右图可知，当酶解时间为105 min时，随果胶酶用量和酶解温度的增加，透光率先升高后降低。图（b）中当酶解温度为40℃时，随果胶酶用量的增加，透光率先升高后降低。由此可知，当果胶酶用量低时，酶解时间越长透光率越大，果胶酶用量高时，时间越长则透光率越低。图（c） 所示，果胶酶用量为0.05 g/L时，酶解温度高时，酶解时间影响不大，酶解温度低时，酶解时间越长透光率越大；酶解时间短时，酶解温度越高透光率越大，酶解时间长时，酶解温度越高透光率越小。

2.6 最佳工艺条件确定与验证

根据Design Expert 8.0.6软件的Optimization程序中Numerical分析，可知得到红玉血橙的最大响应值所对应的因素条件为果胶酶用量0.02 g/L，酶解温度50℃，酶解时间97.59 min，模型预测得到的果汁透光率值为96.8%，实测3次得到透光率的平均值为96.1%，与理论预测吻合，表明采用响应面法优化得到的条件准确可靠。塔罗科血橙最大响应值所对应的因素条件为果胶酶用量0.05 g/L，酶解温度37℃，酶解时间45 min，模型预测得果汁透光率值为95.9%，而实测3次透光率的平均值为95.7%，与理论预测吻合，表明采用响应面法优化得到的条件准确可靠。

3 结论

利用2个不同品种的橙子（红玉血橙、塔罗科血橙）经果胶酶处理后经过722分光光度计对其透光率的测定，得到2个不同品种橙汁的最适澄清工艺参数。红玉血橙的最佳工艺为果胶酶用量0.02 g/L，酶解温度50℃，酶解时间97.59 min，透光率为96.8%；塔罗科血橙的最佳工艺为果胶酶用量0.05 g/L，酶解温度37℃，酶解时间45 min，透光率为95.9%。