酶解罗非鱼下脚料制备降血压肽的研究
2018-11-30张红建谢娇梅郑联合
赵 阔，张红建，陈 艳，邹 易，谢娇梅，郑联合
（海南省粮油科学研究所，海南琼海 571400）
高血压是困扰全球的一种心血管疾病，常伴有血管、大脑、心、肾等器官器质性病变，是诱发中风、冠心病、脑卒死、心肌梗死和肾功能衰竭的最主要因素，被称为“无声杀手”[1-3]，已发展成为一个十分严重的社会公共卫生问题[4]。我国目前的高血压患者达2.7亿人[5]，发病率随着经济的增长逐年增高，每年死于心血管疾病的人数达200万人。当前，应用最普遍、药效最明显的主要是卡托普利、赖诺普利等人工合成的降血压药物，但对肾脏存在一定副作用，服药后会出现干咳、低血压等症状[6]。
降血压肽，是一类能够降低血压的多肽活性物质，通过抑制血管紧张素转化酶（ACE） 的活性，阻碍血管紧张素Ⅱ的生成及抑制血管舒缓激肽的分解，从而使血压下降[7-8]。降血压肽来源于食物蛋白，安全性高、无毒副作用，且对血压正常者无降压作用，适合长期服用，无论在功能性食品还是在医药产品开发方面都具有广阔的应用前景[9-10]。
罗非鱼（Tilapia）俗称非洲鲫鱼、福寿鱼，肉质厚、白洁无刺、味道鲜美，在国际市场很受欢迎，是海南水产品加工企业出口的主要鱼种之一。罗非鱼加工会产生大量的下脚料，如鱼鳞、鱼头、鱼内脏、残肉等，总质量约占整条鱼的54%[11-12]，造成蛋白资源的浪费。为提高罗非鱼下脚料的附加值，开展了酶解制备降血压肽的研究，并优化了工艺参数，为降血压肽的开发和生产提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
罗非鱼下脚料：市购新鲜罗非鱼，将鱼肉剔除，于-20℃条件下冻存，试验时于4℃下解冻。
血管紧张素转换酶（ACE），从新鲜猪肺中提取；胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司提供；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器
UV-8000S型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限责任公司产品；HDK-6型数显恒温磁力搅拌水浴锅，常州德科仪器制造有限公司产品；S-D200型高效组织捣碎机，上海模具厂产品；Sigma 3-30k型高速冷冻离心机，上海誉鑫科技有限公司产品；RG-18型磁力搅拌器，上海玛尼仪器设备有限公司产品；QDN-ll型全自动凯氏定氮仪，杭州汇尔仪器设备有限公司产品；PB-10型pH计，德国赛多利斯科学仪器有限公司产品；SB5200DTD型超声波清洗机，宁波新艺生物科技有限公司产品；玻璃干燥器，沈阳一化玻商贸有限公司产品；AY220型电子天平，日本岛津公司产品；UPN-11-10T型超纯水制造系统，四川优普超纯科技有限公司产品。
1.3 方法
1.3.1 罗非鱼下脚料酶解
称取一定质量的罗非鱼加工下脚料，将其剪成小块，按所需底物质量分数加水，用高速组织捣碎机绞碎，调节所需pH值，在设定温度下加酶水解一定时间，沸水浴灭活10 min，冷却后以转速3 500 r/min离心10 min，中间部分的澄清液即为酶解液。
1.3.2 蛋白酶的筛选[13]
选取6种常用蛋白酶（碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和复合蛋白酶），结合生产厂家提供的各种蛋白酶的最适酶解条件，调节pH值和酶解温度，分别对罗非鱼下脚料进行水解，根据水解度和ACE抑制率，筛选出最佳用酶。
蛋白酶水解条件见表1。
表1 蛋白酶水解条件
1.3.3 酶解工艺优化
选取水解作用较强的酶，在单因素试验的基础上，以酶解温度、加酶量、底物质量分数和pH值4个因素开展L16（35）正交试验，以水解度和ACE抑制率为指标，对酶解条件进行优化。
正交试验因素与水平设计见表2。
表2 正交试验因素与水平设计
1.3.4 水解度测定的方法[14]
水解度（DH） 指蛋白质分子发生酶解反应后断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键的比例，反映蛋白质的水解程度。
氨基酸态氮（AAN） 含量的测定（参照GB 5009.235—2016中比色法）。
总氮含量的测定（参照GB 5009.5—2016中凯氏定氮法）。
1.3.5 ACE抑制率测定的方法[15]
在 2 mL离心管中混合 50 μL样品和 200 μL 0.005 mol/L HHL。置于37℃水浴中预热5 min，然后加入50 μL粗提的ACE启动反应；于37℃下水浴30 min，而后加0.2 mL 1 mol/L盐酸终止反应；吸取1.2 mL预冷的乙酸乙酯于管中，用力振荡混合，以转速3 500 r/min离心5 min。吸取0.8 mL上层液于试管中，于85℃烘箱中烘干；最后，加入4 mL去离子水溶解马尿酸，于波长228 nm处测定其吸光度。对照组不加入抑制剂，空白组反应前加入0.2 mL 1 mol/L的盐酸终止反应，其余操作与样品组操作一致。
式中：ODa——对照组的吸光度；
ODb——样品组的吸光度。
2 结果与分析
2.1 蛋白酶的筛选
6种蛋白酶分别在各自最适酶解条件下酶解处理罗非鱼加工下脚料。
不同蛋白酶酶解罗非鱼下脚料效果见图1。
由图1可知，6种蛋白酶对罗非鱼下脚料的酶解能力由高到低依次为复合蛋白酶＞胃蛋白酶＞碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶；各酶解液ACE抑制率由高到低依次为复合蛋白酶＞胃蛋白酶＞中性蛋白酶＞碱性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶。水解度低的中性蛋白酶酶解产物ACE抑制率却不低，可见水解度和ACE抑制率并无显著直线线性关系，分析原因可能是因为各蛋白酶的作用方式和作用位点有所不同，导致酶解产物ACE抑制率不同。综合考虑，确定选取复合蛋白酶为目标用酶，该酶反应条件相对温和、试验条件易于控制、水解度和ACE抑制率相对较高。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 酶解温度对酶解反应的影响
配制5份底物质量分数为20%的罗非鱼下脚料溶液，调节pH值至7，加入复合蛋白酶，加酶量（E/S%） 为 10 000 U/g，分别在 40，45，50，55，60℃下酶解5 h，之后沸水浴中加热10 min，离心，测定各酶解液的水解度和ACE抑制率，分析不同温度对酶解反应的影响。
酶解温度对酶解反应的影响见图2。
由图2可知，随着酶解温度的升高，水解度和抑制率均呈先上升后下降的趋势，当酶解温度达到50℃时，水解度和抑制率达到最高；当酶解温度超过50℃，酶活性降低，水解度和抑制率开始下降。适宜温度是保持酶活力的关键，不适宜的温度会破坏蛋白酶活性部位的完整性，从而对其酶解作用能力造成影响。因此，复合蛋白酶水解罗非鱼加工下脚料的最佳酶解温度为50℃。
2.2.2 加酶量对酶解反应的影响
配制5份底物质量分数为20%的罗非鱼下脚料溶液，调节pH值至7，加入复合蛋白酶，加酶量（E/S%） 分别为 6 000，8 000，10 000，12 000，14 000 U/g，于50℃下酶解5 h，灭活、离心，测定各酶解液的水解度和ACE抑制率，分析不同加酶量对酶解反应的影响。
加酶量对酶解反应的影响见图3。
由图3可知，水解度随加酶量的增加而增大，并逐渐趋于平缓。加酶量增加到12 000 U/g时，酶解液ACE抑制率最高，之后加酶量增加ACE抑制率降低，可能是因为酶活过高引起了降血压肽的进一步水解。因此，复合蛋白酶水解罗非鱼加工下脚料的最佳加酶量为12 000 U/g。
2.2.3 底物质量分数对水解反应的影响
配制底物质量分数分别为10%，15%，20%，25%，30%的罗非鱼下脚料溶液各1份，调节pH值至7，加入复合蛋白酶，加酶量（E/S%）为10 000 U/g，于50℃下水解5 h，灭活、离心，测定各酶解液的酶解度和ACE抑制率，分析不同底物质量分数对酶解反应的影响。
底物质量分数对酶解反应的影响见图4。
由图4可知，酶解度和抑制率随底物质量分数的增加基本呈上升趋势，分析原因可能是因为底物质量分数低时，降低了酶的浓度，使得酶与底物无法充分接触，影响了酶解效果，当底物质量分数增加到20%时，水解度和抑制率达到最大值，之后，底物质量分数增加水解度变化不明显，抑制率略有下降。因此，复合蛋白酶水解罗非鱼加工下脚料的最佳底物质量分数为20%。
2.2.4 pH值对酶解反应的影响
配制底物质量分数为20%的罗非鱼下脚料溶液5份，分别调节pH值至 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，加入复合蛋白酶，加酶量（E/S%） 为10 000 U/g，在水解温度50℃下酶解5 h，灭活，离心，测定各酶解液的酶解度和ACE抑制率，分析不同pH值对酶解反应的影响。
pH值对水解反应的影响见图5。
由图5可知，pH值＜7.5时，水解度和抑制率随着pH的升高而增加；pH值＞7.5时，pH值升高水解度和ACE抑制率反而减小。pH值直接影响到酶和底物分子的某些解离状态，从而影响酶解效果。因此，复合蛋白酶解罗非鱼下脚料的最佳pH值为7.5。
2.3 正交试验结果
根据单因素试验结果，以酶解温度、加酶量、底物质量分数和pH值4个因素，以酶解度和ACE抑制率为指标，开展正交试验。
复合蛋白酶酶解正交试验结果见表3，复合蛋白酶酶解正交试验结果方差分析见表4。
表3 复合蛋白酶酶解正交试验结果
由表3可知，影响水解度的因素主次顺序为A＞C＞D＞B，即酶解温度＞底物质量分数＞pH值＞加酶量，最优组合为A2B3C3D3；而影响抑制率的因素主次顺序为C＞A＞D＞B，即底物质量分数＞水解温度＞pH值＞加酶量，最优组合为A2B2C3D3。2个组合的差别仅在于因素B是取第二水平还是第三水平。由表4可知，水解温度（A） 和底物质量分数（C） 对水解度和抑制率均影响显著，加酶量（B）和pH值（D）对水解度合抑制率均没有显著影响，且加酶量对抑制率影响比对水解度影响要强。因此，将加酶量的最适条件优化为B2，符合蛋白酶水解工艺的最适组合为A2B2C3D3，即水解温度47℃，加酶量12 000 U/g，底物质量分数20%，pH值7.5。以最适组合条件进行验证试验，罗非鱼下脚料酶解度和抑制率分别为77.45%和70.12%。
表4 复合蛋白酶酶解正交试验结果方差分析
3 结论
通过对比胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶等6种蛋白酶酶解罗非鱼下脚料的效果，确定复合蛋白酶为目标用酶，该酶反应条件相对温和、试验条件易于控制、水解度和ACE抑制率相对较高。通过单因素试验和正交试验，对复合蛋白酶水解罗非鱼下脚料制备降血压肽的工艺条件进行了优化，最适条件为水解温度47℃，加酶量12 000 U/g，底物质量分数20%，pH值7.5，此工艺条件下酶解度与抑制率分别为77.45%和70.12%。
