电针对脑卒中后抑郁大鼠脑细胞生长因子EGF、BFGE表达的影响

余 涛 陆方琴 严嘉宁 赵立峰 韦登明

(宁波大学医学院病理学教研室，浙江 宁波 315211)

脑卒中后抑郁(PSD)指脑卒中导致的有明显临床症状的一种继发性抑郁症，是脑卒中发生后以情绪低落、兴趣减退为主要表现的一种心理障碍。电针治疗是一种安全无毒疗效显著的治疗手段，前期研究已经确定其对PSD有治疗效果〔1〕。但其治疗机制尚不完全清楚。有研究证实，普通慢性抑郁症患者或动物均出现海马体积减少的现象，海马体积的减少与海马神经发生障碍有关。表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)被证实能促进胚胎或成年神经干细胞的分裂增殖〔2〕。但PSD的发病及电针治疗机制是否与海马BFGF和EGF表达变化有关，尚有待研究。本实验拟分析电针对PSD大鼠海马神经细胞发生的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 Wistar大鼠40只，购于浙江大学医学院实验动物中心，动物合格证号0102016。均为雄性，体重280～320 g，自由饮食。大鼠适应性喂养7 d后，随机分为正常组、假手术组、模型组和电针治疗组，每组10只，采用Open-field法进行行为学检测。

1.2试剂仪器 G6805电针仪(上海华谊仪器制造厂生产)，旷场及记录仪(上海移数动物学系统)，兔抗大鼠EGF、BFGF多克隆抗体，生物素化羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G、SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，JD801形态学图像分析系统(江苏捷达有限公司)，BM-Ⅶ包埋机(宏业医用仪器公司)，HM-325石蜡切片机(德国LEICA公司)，CX40生物显微镜(日本olympus公司)。

1.3模型制备 脑卒中模型制备和PSD模型制备。脑卒中模型制备参照王蕊等〔3〕推荐的方法对模型组、电针治疗组进行造模，将大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg体重)麻醉后，仰卧位固定在手术台上，常规消毒，颈正中切口，暴露双侧颈总动脉(CCA)并分离出迷走神经。随即用无创动脉夹夹闭CCA，夹闭10 min再通20 min，再夹闭10 min。青霉素粉剂局部消毒再缝合伤口，放回笼中保温饲养。假手术组麻醉及手术过程同上，但不夹闭CCA。正常组不做任何处理。模型成功的标志是大鼠即刻出现Horner征。PSD模型制备参照洪灯等〔4〕的方法，对脑卒中模型成功的大鼠予以慢性温和应激(CUMS)制备PSD模型。具体操作：①夹尾1 min；②禁水17 h；③4℃强迫游泳5 min；④持续光照17 h；⑤水平摇晃5 min；⑥倾斜鼠笼(45°)17 h；⑦湿笼(100 g锯屑+200 ml水)21 h；⑧行为限制(束缚)2 h；⑨禁食禁水20 h。9种刺激每日随机采取1种，但同种刺激不连续出现，连续不间断刺激21 d。

1.4电针治疗方法 进行不同时间周期连续治疗。电针治疗组大鼠术后1 w手术切口已基本愈合。PSD模型制备成功后伤口已痊愈，开始给予电针治疗。针刺穴位参考《实验针灸学》〔5〕：用28号30 mm长毫针，于百会穴(顶骨正中)斜刺1.67 cm，大椎穴(第7颈椎与第1胸椎间背部正中)正刺1.67 cm。连接G6805电针仪，施以连续波，频率50 Hz，强度以大鼠安静耐受为度(约2.0 rflA)，每天电针1次，留针20 min，连续治疗15 d。

1.5行为学检测 参照林晓春等〔6，7〕的旷场试验法：将大鼠单个放入开野箱的中央格，开始记录其活动。以双后肢穿越一方格边界记为一次水平运动，以两前肢离地且直立记为一次垂直运动，二者反映动物的探究活动，检测6 min(其中第1分钟不计，使大鼠适应环境，共计5 min数据)，实验期间保持环境安静与黑暗。及时清除每只动物的排泄物，并喷洒酒精去除箱底、边异味，各组交替测试。每只动物进行1次(1次/6 min)。测定5 min内箱内大鼠水平运动次数和垂直运动次数。旷场试验的水平活动反映大鼠运动活动性水平；垂直活动的多少则反映其兴趣高低。分别在造模前、造模后和治疗后测定大鼠行为变化。

1.6脑组织生长因子免疫组织化学染色方法 实验结束后，灌注固定后取脑，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 ml/100 g体重)，暴露心脏，先用静脉套管针经主动脉用100 ml生理盐水进行冲洗，再灌注由4%多聚甲醛与1%戊二醛组成的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)200 ml，灌注约40 min，灌注完毕后断头取大脑组织。将取出的脑组织浸没于装有甲醛固定液管中，并置于-80℃冰箱保存24 h。

石蜡包埋切片制作并进行免疫组织化学染色：切片经常规脱腊、脱水、3%过氧化氢(H2O2)在37℃下处理15 min;微波抗原修复后滴加10%正常羊血清在37℃下处理 10 min，勿洗;滴加1∶100稀释的一抗(抗BFGF、EGF)，在4℃下处理24 h;滴加生物素化羊抗兔IgG二抗(1∶100)在37℃下处理2 h;滴加SABC适量，在37℃下处理1 h;二氨基联苯胺(DAB)显色5～10 min;阴性对照实验用PBS代替一抗，其余步骤相同。每步之间用0.1 mol/L PBS(pH值7.4)洗3次，每次5 min。常规脱水、透明、封片，光学显微镜下观察免疫组化染色结果。结果判断：显微镜下海马神经细胞胞质呈棕色为阳性细胞，每张切片在400倍显微镜下选取4个视野用 RY-2000瑞医病理图文分析系统计算其积分光密度〔8〕。

1.7统计学检测 采用SPSS13.10统计软件进行单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组BFGF、EGF积分光密度比较 正常组、假手术组脑组织见较多EGF和BFGF免疫阳性细胞;模型组很少，较正常组显著下降(P<0.05)。电针治疗组较模型组EGF和BFGF积分光密度值明显增高(P<0.05)，见图1，表1。

图1 各组脑组织EGF、BFGF免疫阳性细胞比较(×400)

表1 各组BFGF、EGF积分光密度比较

与模型组比较：1)P<0.05；同表2

2.2各组水平、垂直运动次数比较 正常组与假手术组水平、垂直运动次数差异无统计学意义(P>0.05)，模型组较正常组和假手术组明显减少(P<0.05)，电针治疗组较模型组明显增多(P<0.05)，见表2。

表2 各组水平、垂直运动次数比较次)

3 讨 论

PSD相当于中医学中“郁证”的范畴，属于因病致郁〔9，10〕，其病因机制复杂，发病机制尚不清楚。有文献〔11〕报道，脑卒中后第1年的PSD发病率为20%～50%。PSD 不仅影响患者神经及肢体功能的康复，降低生活质量及生活满意度，同时也增加了脑卒中病死率，给患者亲属带来精神和经济上的极大负担。

目前西药在PSD的治疗中明显存在副作用严重、起效慢、价格昂贵等问题。中药方面，肖潇〔12〕以逍遥散加味为基本方治疗，在改善患者中医症状、对患者神经功能缺损的改善及提高患者日常生活能力方面效果颇好，且起效快，副作用少；陈德仁〔13〕用丹栀逍遥散加减治疗PSD，患者症状显著改善，生活自理能力有所提高。Kim等〔14〕发现电针可改善抑郁状态，王忠华〔15〕电针治疗PSD，发现治疗效果优于口服百忧解。针刺作为一种传统的治疗手段正逐渐被接受，其在改善患者临床症状及生活质量方面疗效确切，已成为药物治疗抑郁症的有效补充〔16〕。百会和大椎是2个益智要穴，位于督脉之上。百会位居巅顶，为手足三阳经与督脉及阴肝经之会，为督脉要穴，百脉聚会之处，故可调补中气，健脑宁神；大椎为“三阳督脉之会”〔17〕。针刺两穴，可醒脑益智开窍、振奋阳气，并达阳以生阴之功〔11〕。以往研究表明，电针百会、大椎穴有提高脑卒中大鼠海马神经突触素(Syp)表达和增加海马神经元数量的作用，从而增强海马突触可塑性，而海马神经突触可塑性提高与促进海马神经细胞发生有关〔18〕。故本实验选穴以督脉之百会、大椎为治疗穴。

脑卒中发病时，脑组织的缺血缺氧使神经元能量代谢发生障碍，引起谷氨酸大量释放，导致谷氨酸受体过度活化，产生兴奋性毒性，导致神经元变性、死亡〔19〕。BFGF主要定位于海马CA2神经元〔20〕，可以作为反映创伤愈合的细胞因子；EGF主要定位于嗅球、下丘脑及小脑神经元组织中〔21〕。有研究表明BFGF可以促进有丝分裂，促进微血管的生长及分化，增加局部毛细血管数，促血管生成，在神经损伤中保护神经元细胞，促进神经胶质细胞分裂增殖〔22〕。BFGF不仅能缩小大鼠脑梗死面积，还可以使缺血损伤后的脑血流量显著增加。在脑缺血损伤的治疗中，能使神经再生，从而促进脑缺血后的神经功能恢复〔23〕。EGF对于哺乳动物细胞是强力的有丝分裂因子，可促进中枢神经系统神经元祖细胞、神经元及神经胶质细胞增殖和分化。其还是一个重要的神经营养因子，可通过刺激甲状腺激素和多功能蛋白聚糖G3片段来促进神经突生长〔24〕。EGF具有与BFGF类似的作用，二者不仅具有有丝分裂原的作用，还可促进细胞分化并决定细胞分化方向，实验证明BFGF和EGF联合使用，可诱导骨髓基质细胞化(BMSCs)分化为神经样细胞〔25〕。而对神经干细胞分化方向上的影响存在明显差异，BFGF作用下分化的细胞主要表达神经元细胞特异性标志分子，EGF作用后则主要分化为神经胶质细胞〔26〕。本研究行为学结果提示，电针对PSD大鼠的抑郁治疗有效。本研究免疫组织化学染色结果表明，电针对PSD大鼠神经元的修复与再生有促进作用。因抑郁症患者海马体积缩小，结合本实验结果认为，针刺改善PSD大鼠神经元的修复与再生的机制可能由于提高了海马神经生长因子BFGF和EGF的含量，从而对海马神经元的可塑性进行调节，促进海马神经细胞发生和神经功能的恢复，这可能是针刺抗抑郁的分子机制之一，电针对调节PSD大鼠海马神经再生的具体机制有待于进一步研究加以明确。