黄芩素联合U0126调控人膀胱癌T24细胞凋亡的分子机制

伍连春 陈杰翔 喻小兰 唐小平 王晓燕 张宇骄 夏纪毅，5

(内江市隆昌县中医医院泌尿外科，四川 内江 642150)

膀胱癌的发生发展与癌细胞的失控增殖、恶性转移和凋亡息息相关〔1〕。膀胱癌的治疗策略之一是促进癌细胞凋亡。细胞增殖和凋亡平衡失控是导致癌变的重要原因〔2〕。B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)可促进细胞凋亡，而Bcl-2抑制细胞凋亡，二者相互拮抗，Bcl-2/Bax比值与细胞凋亡密切相关〔3〕。促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)参与细胞增殖、分化及癌变，主要包括细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2和P38等信号蛋白，通过调控多种癌基因，促进细胞过度增殖、分化和凋亡，在乳腺癌、结肠癌和肺癌等恶性癌症中发挥作用。U0126是MAPK抑制剂，可抑制癌细胞增殖，促进凋亡〔4〕。中药黄芩素在肿瘤中可发挥抑癌作用〔5〕，但黄芩素联合U0126在膀胱癌中的作用和分子机制还有待进一步研究。

1 材料与方法

1.1材料 人膀胱癌T24细胞株从西南医科大学附属医院医学实验中心获赠，细胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/ml链霉素(美国invitrogen公司)的改良杜氏伊格尔(DMEM)培养液(美国hyclone公司)，于37℃、5%CO2细胞孵育箱(型号：HERAcell 240i，美国Thermo Scientific Forma公司)内常规培养。黄芩素(四川成都曼斯特科技公司，纯度≥ 98%，批号A0779)；U0126(碧云天生物科技公司，批号S1901)，内参3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(碧云天生物科技公司，批号AG019)，细胞增殖-毒性检测(CCK8)试剂盒(南京凯基生物有限公司，批号C0037)，ERK1/2、Bax、Bcl-2、P38引物由上海生工合成，对应的抗体均购于Cell signal technology公司(ERK1/2批号4695，p-ERK1/2批号9101，P38批号8690，磷酸化(p)-P38批号4511，Bax 批号14796，Bcl-2批号15071)。碘化丙啶(PI)染色液(批号550825，美国BD Biosciences公司)。Annexin V/PI试剂盒(批号556547，美国BD Biosciences公司)。反转录试剂盒(型号：K1622，美国Thermo Fermentas公司)，流式细胞检测仪(型号：BD FACSAria Ⅱ，美国BD Biosciences公司)。全波长酶标仪(型号：Multiskan Spectrum，美国Thermo Electron公司)。

1.2方法

1.2.1CCK8检测细胞增殖 制备T24细胞悬液，计数细胞；将2×105个细胞接种至96孔板中，每孔100 μl，随机分为对照组、黄芩素组(加入20 μmol/L黄芩素培养24 h)、U0126组、(加入20 μmol/L U0126培养24 h)、黄芩素联合U0126组(加入20 μmol/L黄芩素和20 μmol/L U0126共同培养24 h)，每组设置3个复孔，培养24、48、72 h，每个时间点加入10 μl CCK8，混匀；培养4 h，在450 nm处检测吸光度，计算各组细胞增殖率。实验重复3次。

1.2.2流式细胞术检测细胞周期 膀胱癌细胞株T24接种于12孔板，按各分组处理后，收集细胞，室温磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入1 ml 70%预冷乙醇固定过夜，第2天离心去除乙醇，PBS重悬，加入RNase至终浓度为100 mg/L，37℃水浴30 min，加入PI染色液至终浓度为50 mg/L，4℃避光染色30 min，用激发波长为488 nm的红色荧光检测细胞周期。结果采用细胞周期拟合软件进行分析，实验重复3次。

1.2.3流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡 各组细胞用Annexin V/PI试剂盒染色，流式细胞仪检测早期凋亡和晚期凋亡。实验操作按照试剂盒说明书严格执行。收集悬浮细胞，PBS漂洗2次，加入400 μl 1×结合缓冲液(Binding Buffer)重悬细胞，接着加入5 μl Annexin V-FITC，混匀，室温避光孵育15 min加入10 μl PI染色液，混匀，避光孵育5 min，流式细胞仪检测早期凋亡和晚期凋亡。检测结果采用CellQuest软件进行分析。实验重复三次。

1.2.4Real Time PCR检测细胞ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38 mRNA水平 将各组细胞弃掉培养基，PBS漂洗2遍，Trizol提取总RNA，并以此为模板，Oligo(dT)为引物，采用反转录试剂盒K1622反转录成cDNA第一链，采用Real Time PCR检测凋亡相关基因的表达水平。引物序列：ERK1/2：前向：AATCACACGGTAGACACTGAAATGCC，反向：CATCATCCCATCTAAAATGTCCCCTG；Bax：前向：CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG，反向：CCAGCCCATGATGGTTCTGAT；Bcl-2：前向：GGTGGGGTCATGTGTGTGG，反向：CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC；P38：前向：CCCGAGCGTTACCAGAACC，反向：TCGCATGAATGATGGACTGAAAT；GAPDH：前向：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，反向：TGGTGAAGACGCCAGTGGA。

1.2.5Western印迹检测细胞ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38蛋白表达和对ERK1/2、P38磷酸化的影响 将各组细胞弃掉培养基，PBS洗2次，加入含5%蛋白酶抑制剂的强裂解液RIPA，冰上裂解20 min，15 000 r/min离心后取上清液，超声破碎后，收集细胞总蛋白，-20℃保存备用。取10 μg蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转膜到0.2 μmol/L聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉的1×Tris-HCl缓冲盐吐温溶液(TBST)封闭1 h。ERK1/2、Bax、Bcl-2、P38、p-ERK1/2、p-P38和GAPDH(稀释比例分别为1∶1 000，1∶800，1∶500，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶2 000)一抗4℃孵育过夜。1×TBST漂洗2次，10 min/次，加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗IgG(H+L)，室温孵育1 h，1×TBST漂洗2次，5 min/次，凝胶成像仪成像后进行灰度分析，计算相关蛋白的表达水平。试验重复3次。

1.3统计学分析 采用SPSS19.0软件，组间比较采用t检验，多个样本之间的两两比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1黄芩素联合U0126对人膀胱癌T24细胞增殖的影响 单独应用黄芩素、U0126或联合应用黄芩素和U0126可显著抑制细胞增殖，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，且具有时间依赖性，而黄芩素联合U0126作用对膀胱癌细胞的抑制作用更加明显(P<0.01)，见表1。

表1 黄芩素联合U0126对人膀胱癌T24细胞增殖的影响

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.2流式细胞术检测黄芩素联合U0126对T24细胞周期的影响 单独应用黄芩素、U0126或联合应用黄芩素和U0126 作用24 h，G0～G1期细胞含量增多，S期细胞下降，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，而黄芩素联合U0126作用对细胞周期的影响更加显著(P<0.01)，说明二者联合使用具有协同效应，见表2。

表2 黄芩素联合U0126对人膀胱癌T24细胞周期的影响

2.3流式细胞术检测黄芩素联合U0126对T24细胞凋亡的影响 单独应用黄芩素、U0126或联合应用黄芩素和U0126 作用T24细胞24 h，早期凋亡率和晚期凋亡率增多，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而黄芩素联合U0126作用对T24细胞早期凋亡率和晚期凋亡率的诱导更加显著(P<0.01)，说明二者联合使用具有协同诱导肿瘤细胞凋亡的效应，见表3。

表3 黄芩素联合U0126对人膀胱癌T24细胞凋亡的影响

2.4Real Time PCR检测黄芩素联合U0126对T24细胞ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38 mRNA水平的影响 单独应用黄芩素、U0126或联合应用黄芩素和U0126 作用T24细胞24 h，Bax mRNA表达增加，Bcl-2 mRNA表达减少，ERK1/2和P38 mRNA水平显著降低，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，而黄芩素联合U0126作用对T24细胞ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38 mRNA的影响更加显著(P<0.01)，见表4。

2.5Western印迹检测黄芩素联合U0126对T24细胞Bax、Bcl-2蛋白及P38 ERK1/2磷酸化的影响 单独应用黄芩素、U0126或联合应用黄芩素和U0126 作用T24细胞24 h，Bax蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达减少，而ERK1/2和P38磷酸化水平显著降低，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；而黄芩素联合U0126作用对Bax、Bcl-2蛋白和P38、ERK1/2磷酸化的影响更加显著(P<0.01)，见图1，表5。

表4 各组ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38 mRNA相对表达量分析

1.对照组；2.黄芩素组；3.U0126组；4.黄芩素联合U0126组图1 黄芩素联合U0126对T24细胞Bax、Bcl-2蛋白及P38、ERK1/2磷酸化的影响

表5 Bax、Bcl-2蛋白相对表达量和p-ERK1/2、p-P38 磷酸化水平分析

3 讨 论

膀胱癌是泌尿系统最常见的癌症，膀胱上皮性肿瘤占95%～98%，其中移行细胞癌约占90%，少数鳞状上皮癌和腺癌等非上皮性肿瘤占2%～5%〔6〕。膀胱癌的发生发展与细胞增殖和凋亡息息相关，多种生长因子、癌基因及它们之间的相互作用在膀胱癌的增殖和凋亡中发挥着重要作用〔7〕。

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最重要的两个成员，主要分布于细胞质中的线粒体、内质网和核膜上，Bax可拮抗Bcl-2的功能，促进细胞凋亡；Bcl-2对多种因素介导的凋亡产生抗性，抑制细胞凋亡〔8〕。本研究结果表明，单独使用黄芩素或U0126作用T24细胞，可促进Bax表达升高，Bcl-2表达降低，而黄芩素和U0126联合使用使Bax表达升高及Bcl-2表达降低的作用更加显著，进而促进肿瘤细胞的早期凋亡和晚期凋亡。

MAPK是丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，其主要成员ERK激活或磷酸化与细胞增殖有关〔9〕。ERK/MAPK信号通路可被生长因子、血清、GPCR的配体和转录因子等激活，将细胞外刺激传递至细胞核，参与细胞正常的生长、发育和分化〔10〕。同时，ERK信号通路还可参与细胞的恶性转化和癌症的发生发展，近年来的研究发现，ERK1/2在膀胱癌中被显著激活，促进细胞增殖〔11〕。本研究结果表明，单独使用黄芩素或U0126作用T24细胞，可抑制ERK1/2 mRNA和蛋白的表达，ERK1/2磷酸化显著降低；联合使用黄芩素和U0126作用于细胞，对ERK1/2 mRNA和蛋白的抑制作用及抑制ERK1/2磷酸化作用更加显著，进而抑制肿瘤细胞的增殖能力，绝大多数细胞停留在G0～G1期，细胞凋亡能力显著增强。

在膀胱癌患者中，P38的表达和磷酸化水平显著增加，因此，P38信号通路在膀胱癌的发生发展中起着重要作用〔12〕。本研究结果表明，单独使用黄芩素或U0126作用T24细胞，可抑制P38 mRNA和蛋白的表达，P38磷酸化显著降低，联合使用黄芩素和U0126作用于细胞，对P38 mRNA和蛋白的抑制作用及抑制ERK1/2磷酸化作用更加显著，肿瘤细胞增殖受到抑制，凋亡显著增强。因此，联合使用黄芩素和U0126可通过调控ERK1/2和P38信号通路作用于膀胱癌。

综上所述，黄芩素联合U0126具有协同效应，可通过调控ERK1/2和P38信号通路抑制人膀胱癌细胞增殖，改变细胞周期，进而诱导肿瘤细胞凋亡，为膀胱癌治疗和机制研究提供参考依据。