洋葱表皮细胞染色方法的优化

陈文荣 胡盈盈 沈芷琦 陈秉初

(浙江师范大学化学与生命科学学院 金华 321004)

洋葱鳞片叶表皮细胞实验是生物学教学的基础实验。在实验教学中，学生能观察到细胞核、细胞质、细胞壁和细胞膜等简单细胞结构。经典的染色剂为I2-KI试剂，其基本原理为I2与蛋白质发生显色，细胞质内的蛋白质浓度较细胞核内的低，细胞质显浅棕黄色，细胞核显深棕黄色。在教学实践中，碘染色所需时间过长，染色效果单一，观察效果不佳。有人尝试使用Feulgen染色法[1]、甲基绿-派洛宁染色法[2]、中性红染色[3]、孔雀绿染色、ZnO作用等较为创新的染色方法将洋葱鳞片叶表皮细胞染色，但实验步骤较为繁琐，不适合于中学实验教学。本文以洋葱鳞片叶表皮为材料，从有机试剂(如碱性品红、亚甲基蓝、固绿、苏木精等)和无机染料[如24.5%H2SO4、饱和Fe2(SO4)3溶液、饱和CuSO4溶液、0.5mol/L Li2SO4溶液等]进行单染色和交互染色，以寻求更好的染色效果，丰富植物细胞染色色系，并为中学实验教学提供更多的染色方法选择及更为丰富的染色效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料 放置7d左右的洋葱。试剂： 碱性品红、固绿、亚甲基蓝、苯胺蓝、核固红、苏木精、次甲基蓝、98% H2SO4、Fe2(SO4)3、CuSO4、Li2SO4、碘液、酒精、蒸馏水。

1.2 试剂配制 本研究相关试剂配制方法如下：

试 剂配置方法核固红染色液称取0.500g固绿溶于50mL 95%酒精苯胺蓝染色液称取0.050g苯胺蓝和1.000g K2HPO4溶于50mL蒸馏水亚甲基蓝染色液称取0.830g亚甲基蓝溶于50mL蒸馏水(水温为35℃～40℃),直至完全溶解,再冷却至20℃固绿染色液称取0.500g固绿溶于50mL 95%酒精苏木精染色液称取0.500g苏木精溶于50mL无水酒精,让其氧化成熟4周次甲基蓝染色液称取0.050g次甲基蓝溶于50mL 50%酒精碱性品红染色液称取0.750g碱性品红溶解于50mL 70%酒精24.5% H2SO4溶液取98% H2SO4 10mL稀释3倍饱和Fe2(SO4)3溶液取过量的Fe2(SO4)3溶于50mL的蒸馏水中,溶解至饱和,过滤饱和CuSO4溶液取过量的CuSO4溶于50mL的蒸馏水中,溶解至饱和,过滤0.5mol/L Li2SO4溶液碘液称取5.5g Li2SO4溶于少量的蒸馏水中,定容至50mL称取1.1g I2和2.2g KI溶于少量蒸馏水中,定容至50mL

1.3 实验步骤 ①取材： 用镊子取适量洋葱的外(内)表皮，置于载玻片上；②醇洗[4]： 将撕取的洋葱表皮置于75%酒精中浸泡1min；③水洗： 用缓慢的蒸馏流水洗涤；④染色： 滴加相应的染色剂，进行染色；⑤水洗： 用缓慢的蒸馏流水冲洗，充分洗去浮色，直至所流下的水为无色；⑥盖片观察： 盖上盖玻片，置于显微镜下观察。

1.4 染色方法 具体步骤如下：

(1) 有机试剂单染色 核固红、亚甲基蓝、固绿、次甲基蓝进行染色，染色时长为10min；使用苯胺蓝进行染色时，染色时长为15min；使用苏木精进行染色时，染色时长为5min；使用碱性品红染色时，染色时长为1min。

(2) 无机试剂单染色 使用24.5% H2SO4溶液、饱和Fe2(SO4)3溶液染色、饱和CuSO4溶液染色、0.5mol/L Li2SO4溶液进行染色时，染色时长均为10min。

(3) 交互染色 12.25% H2SO4+亚甲基蓝、24.5% H2SO4+核固红、24.5% H2SO4+亚甲基蓝、24.5% H2SO4染色+固绿及碘液+24.5% H2SO4各组别中，前后两种染色剂均染色7～10min；6.225% H2SO+碘液中，前后两种染色剂均染色5min；碘液+固绿中，前者染色5min，后者染色25min；固绿+碘液，前者染色10min，后者染色5min；苯胺蓝+核固红、核固红+苯胺蓝、苯胺蓝+固绿、核固红+固绿、固绿+亚甲基蓝和亚甲基蓝染+碘液各组别中，前后两种染色剂均染色7min；固绿与亚甲基蓝的混合液、品红与亚甲基蓝的混合液和固绿与碱性品红的混合液，均染色7～10min。

2 研究结果

2.1 有机染料单染色 有机染料染色效果中，次甲基蓝与碱性品红的染色效果最好，染色清晰，大部分细胞着色均一。苏木精与核固红的染色效果次之，苏木精的染色效果与碘液类似，细胞核呈棕黄色，细胞质呈黄色，但在染色时间上有所减少；核固红染色较为清晰，相对传统的碘液染色，染色色系上有所突破，但多数细胞着色深浅不一，观察发现可能是由于核固红染液中的杂质所致。苯胺蓝、亚甲基蓝、固绿的染色效果不佳，对细胞质的染色效果显著，而细胞核未见染色，观察效果不佳(染色效果图请扫文后二维码)。

2.2 无机染料单染色 24.5% H2SO4溶液与饱和Fe2(SO4)3溶液染色效果最好，染色清晰，细胞质、细胞核区分明显，但是细胞着色不均一，部分细胞未被染色。0.5mol/L Li2SO4溶液染色效果次之，细胞核呈绿色，细胞质呈浅绿色，但细胞质呈现颗粒状，影响观察。饱和CuSO4溶液染色效果不佳，对细胞质的染色效果显著，呈黄色，且大部分细胞着色，但未对细胞核有染色效应(染色效果图请扫文后二维码)。

2.3 染色剂交互染色 相应染色效果如下：

2.3.1 硫酸与其他染色液交互染色 硫酸与染色剂的配合使用导致细胞发生质壁分离，从而使细胞膜与细胞壁的界线更为清晰。相较而言，12.25% H2SO4+亚甲基蓝、24.5% H2SO4+亚甲基蓝、24.5% H2SO4+核固红、24.5% H2SO4+固绿的染色效果最好，染色清晰，大部分细胞着色均一，质核区分显著，细胞核比细胞质的颜色深，细胞发生质壁分离，可以更好地区分细胞壁与细胞质。6.225% H2SO4+碘液、碘液+24.5% H2SO4的染色效果一般，大部分细胞着色，细胞质、细胞核可以区分，但是有黑色杂质影响观察(染色效果图请扫文后二维码)。

2.3.2 有机染料交互染色 有机染料的交互染色，不仅改变染色色系，同时也能改进染色剂的着色。相较而言，品红与亚甲基蓝混合液的染色效果最好，细胞核呈深紫色，细胞质呈紫色，染色鲜艳清晰，细胞着色均一，质核区分显著，且内外表皮细胞染色效果均显著。苯胺蓝+核固红、固绿+碘液、固绿+亚甲基蓝、固绿与亚甲基蓝混合液、亚甲基蓝+固绿的染色效果次之，染色较为清晰，大部分细胞着色，细胞质、细胞核明显区分。固绿+碘液和固绿与亚甲基蓝混合液染色后的细胞的细胞质与细胞核颜色呈不同色系，效果类似于甲基绿-派洛宁染色法[2]。苯胺蓝+固绿、核固红+固绿的染色效果一般，大部分细胞着色，细胞质、细胞核可以区分，但是有杂质影响观察。核固红+固绿、苯胺蓝+固绿染色后的细胞的细胞壁呈绿色[4]，有助于观察。亚甲基蓝+碘液、碱性品红与固绿混合液的染色效果最差，大部分细胞着色，前者细胞核染色效果不明显，后者细胞结构破坏(染色效果图请扫文后二维码)。

在交互染色实验中，染色剂的书写顺序即为添加顺序。若无特殊交代染色剂的剂量比，剂量比均为1 ∶1；若无特殊交代实验材料，实验材料均为洋葱鳞片叶外表皮。

3 讨论

无机染色剂中配以24.5% H2SO4溶液导致细胞发生质壁分离，从而使细胞膜与细胞壁的界线更为清晰，且相较于传统的碘染色，颜色更为鲜艳(见硫酸与其他染色剂交互实验染色效果图)；同时，24.5% H2SO4溶液的加入使染色时间显著缩短，其染色机理可能是洋葱表皮细胞内某种物质具有类似于酸碱指示剂的作用；也可能是由于H2SO4作为强酸，使蛋白质变性所致，但系列浓度的HCl、H3PO4等强酸、中强酸的染色实验并未观察到上述染色效果(研究结果本文未包含)。因此，H2SO4溶液的染色原理仍需进一步研究探讨。为获得更好的染色效果，本研究同时进行了H2SO4的浓度梯度染色研究，发现98%、49%的H2SO4会严重破坏细胞结构，细胞呈“解体”状；而12.25% H2SO4无染色现象(相关结果本文未包含)。

染色时间会影响染色效果： 时间过长，原染色为橙色的细胞会变成绿色，这可能是由于显色产物结构不稳定，被空气氧化或者进一步与胞内其他物质反应所致。而无机试剂中的饱和Fe2(SO4)3溶液和饱和CuSO4溶液能使细胞着色，其染色机理可能是有色金属盐使蛋白质变性并产生有色络合物(见硫酸与其他染色剂交互实验染色效果图)。但由于金属离子进入表皮细胞不均衡，因此染色效果差于有机染料，但是在染色剂的种类上有所突破，有利于扩大细胞染色剂的选择范围。在各类常见的有机染色剂染色发现，碱性品红染色效应极强，染色速度也最快，只需染色1min即可观察；且在交互实验中，绝大部分与碱性品红组合的实验，另一种染色剂的效果会被完全地掩盖(见有机染色剂交互染色效果图)。这可能是由于在近中性范围内碱性品红与DNA有较强的结合[4]。

染色剂组合染色往往能改进染色效果，但部分染色组合是染色剂组分独立染色结果，酸性染料使细胞质着色、碱性染料使细胞核着色[5]。而快速细胞染色剂FME也是根据酸性、碱性染料的共同作用使细胞各结构染色。同时，各染色剂的剂量比会显著影响染色效果，在甲基绿—派洛宁染色法较好的配比为3 ∶2和1 ∶1[2]；而碱性品红与亚甲基蓝混合液染色效果最好的配比是1 ∶1，当配比为1 ∶4和1 ∶6会出现类似色素带问题。另外，单染色时对细胞核染色效果不明显的染色剂与24.5%H2SO4溶液共同作用时，对细胞核的染色效果明显增强(见有机染料单染色效果图和硫酸与其他染色剂交互染色效果图)，这可能是由于H2SO4中的H+使细胞核膜失去选择透性，染色剂分子进入细胞核，使细胞核染色。

4 小结

根据研究结果，值得借鉴参考的有： ①红色色系中，碱性品红单染色和24.5% H2SO4+核固红的染色效应好；②黄色色系中，24.5% H2SO4溶液的染色见效快，且获取试剂方便；③绿色色系中，饱和Fe2(SO4)3溶液和24.5% H2SO4+固绿的染色效果佳；④蓝色色系中，次甲基蓝、12.25% H2SO4+亚甲基蓝和苯胺蓝+核固红的染色效果好。

(*通信作者)