二甲四氯在水稻中残留分析方法的研究

廖 敏，单淑芳，李胜男，刘琼琼，潘 凡

1.安徽农业大学植物保护学院，合肥，230036；

2.安徽农业大学农产品质量安全安徽省重点实验室，合肥，230036

二甲四氯(Chipton)，化学名称为2-甲基-4-氯苯氧乙酸(其结构式如图1)，英国玛克斯公司开发的苯氧乙酸类激素型内吸性除草剂[1]。该除草剂选择性强，对水田和旱地中阔叶杂草、莎草的防治效果显著，并且能有效增加作物产量[2,3]。同时，二甲四氯在我国的广泛应用，造成环境污染、人类健康危害等问题也日趋严重，主要表现为残留时间长，影响后茬作物的生长以及对地下水的潜在污染[4]；其代谢物有较强的生物活性，对人和动物具有一定的内分泌干扰作用[5-7]。因此，建立简单、快速的残留分析方法对指导农产品在种植栽培中正确使用二甲四氯具有重要的现实意义。

图1 二甲四氯结构式

目前，针对二甲四氯在不同作物上的残留分析方法及其消解动态已有部分研究。匡科等建立了二甲四氯在水中的气相色谱-负化学源质谱(GC-NCI MS)检测方法[8]。赵慧宇等通过氢氧化钠溶液振荡提取、乙酸乙酯萃取、石墨化碳黑(GCB)净化，建立了二甲四氯在麦苗、麦秆、麦粒中的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法[9]。Hu等通过酸性溶液提取，C18柱净化，反相高效液相色谱法(HPLC-DAD)检测，建立了小麦及土壤中二甲四氯的检测方法[10]。农药在不同基质中的灵敏度、基质效应、选择性等均存在差异[11]。然而，有关二甲四氯在水稻及稻田环境中的残留分析方法鲜有报道，无法为水稻中二甲四氯残留量的监测提供技术支撑。本文建立了HPLC-MS/MS测定稻米、植株、稻壳、土样以及水中二甲四氯残留分析方法，该方法简便、快捷、灵敏度高，具有实用价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

二甲四氯(纯度98.5%)，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，色谱甲醇与水(V/V，1/1)配制成浓度为1000 mg·L-1的母液于4 ℃冰箱保存。

氢氧化钠，乙酸乙酯，均为分析纯，购自西陇化工股份有限公司；磷酸(分析纯)，购自天津市光复精细化工研究所；色谱甲醇，购自河北四友卓越科技有限公司。

高效液相色谱-串联质谱联用仪(Waters ACQUITY HPLC，Waters Xevo TQ MS)，配有ESI离子源，美国Waters公司；超声波清洗器(KQ-600)，华瑞博远(北京)科技有限公司；水浴恒温振荡器(WHY-2)，长沙基隆仪器仪表有限公司；低速离心机(SC-3610)，安徽中科中佳科学仪器有限公司；氮吹仪(N-EVAP 24)，美国Organomation公司；优普系列超纯水器(UPT-11-10T)，成都超纯科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

采用五点取样法，2012年8—10月分别从未施用含二甲四氯成分农药的安徽省合肥市庐江县庐城镇实验稻田中采集水样、土样、水稻植株及稻粒。水样经布氏漏斗过滤；土样经风干、磨碎后过40目筛；水稻植株样品经粉碎机粉碎；稻粒经阴干脱壳获得稻米和稻壳后粉碎。样品采用四分法缩分，-20 ℃低温保存，留作添加回收实验的空白样品。

1.2.2 样品的前处理

比较了乙酸乙酯、甲醇以及乙腈等提取溶剂，通过对提取率和提取样品中杂质含量进行分析，最终确定样品前处理方法如下：

水样：过0.22 μm滤膜后待HPLC-MS/MS检测。

土样：准确称样5 g，加入0.04 mol·L-1的氢氧化钠溶液30 mL，振荡50 min，超声10 min，3500 r/min离心5 min，取15 mL上清液，磷酸调至pH<3.0，加入5 g氯化钠、20 mL乙酸乙酯后超声20 min，振荡10 min，3500 r/min离心3 min，取上清液5 mL氮吹干，2.5 mL甲醇/水(V/V，1/1)溶液定容，过0.22 μm滤膜后待HPLC-MS/MS检测。

稻米：准确称样10 g，加入0.04 mol·L-1的氢氧化钠溶液30 mL，振荡30 min，3500 r/min离心5 min，取15 mL上清液，磷酸调至pH<3.0，加入5 g氯化钠、20 mL乙酸乙酯后超声20 min，振荡10 min，3500 r/min离心3 min，取上清液5 mL氮吹干，2.5 mL甲醇/水(V/V，1/1)溶液定容，过0.22 μm滤膜后待HPLC-MS/MS检测。

植株：准确称样5 g，加入0.04 mol·L-1的氢氧化钠溶液40 mL，轻摇2 min，超声提取15 min后再轻摇2 min，3500 r/min离心5 min，取10 mL上清液，磷酸调至pH<3.0，加入5 g 氯化钠、20 mL乙酸乙酯后超声20 min，振荡10 min，3500 r/min离心3 min，取上清液10 mL氮吹干，2.5 mL甲醇/水(V/V，1/1)溶液定容，过0.22 μm滤膜后待HPLC-MS/MS检测。

稻壳：准确称样5 g，加入0.04 mol·L-1的氢氧化钠溶液40 mL，振荡30 min，3500 r/min离心5 min，取10 mL上清液，磷酸调至pH<3.0，加入5 g氯化钠、20 mL乙酸乙酯后超声20 min，振荡10 min，3500 r/min离心3 min，取上清液10 mL氮吹干，2.5 mL甲醇/水(V/V，1/1)溶液定容，过0.22 μm滤膜后待HPLC-MS/MS检测。

1.2.3 HPLC-MS检测条件

液相色谱条件：考察色谱柱、流动相以及检测条件等因素，最终确定的检测方法如下：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC R BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；流速：0.3 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：40 ℃；流动相：A-含0.1%甲酸的2%甲醇水溶液；B-含0.1%甲酸水的甲醇。洗脱方式：梯度洗脱，时间程序见表1。

表1 高效液相色谱流动相梯度洗脱程序

质谱条件：电喷雾负离子源(ESI)，负离子扫描模式；多反应监测(MRM)；毛细管电压3 KV；反吹气流速50 L·h-1；雾化气流速1000 L·h-1；雾化温度500℃；碰撞气流量0.17 mL·min-1。其质谱参数见表2。

表2 质谱检测条件

注：标*为定量离子

1.3 稻米样品中二甲四氯残留量的检测

对2013年9-10月采集于安徽省合肥市庐江县庐城镇、河南省新乡市原阳县祝楼乡、湖北省武汉市黄陂区王家河镇农田的6个批次的水稻稻米样品按照1.2提供的方法进行二甲四氯残留量分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制备

在1.2.4检测条件下，二甲四氯保留时间为3.02 min，比较二甲四氯在不同离子对下的响应，明确199.0/140.9为定量离子对(m见图2)。按照空白基质背景10倍信噪比，二甲四氯在植株、稻米、稻壳中的最低检测浓度(LOQ)为0.02 mg·kg-1，在土、水样中的LOQ为0.01 mg·kg-1，该方法的灵敏度较好，能够满足该农药的残留分析要求。

图2 二甲四氯MRM色谱图

甲醇/水(V/V，1/1)逐级稀释二甲四氯标准品母液，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，在0.005～0.8 mg·kg-1的浓度范围内，回归方程为：y= 33587x+ 3244.8，相关系数(R2)为0.9993，响应值和浓度之间呈良好的线性关系(见图3)。

图3 二甲四氯的标准曲线

2.2 方法的准确度与精确度

分别在0.01、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00 mg·kg-1的添加水平下，采用内标法测定二甲四氯的回收率。结果表明(表3)，在三个添加水平下，二甲四氯在稻米中的添加回收率分别为111%、96%、94%；在稻壳中的添加回收率分别为98%、102%、94%；在植株中的添加回收率分别为119%、94%、88%；在土样中的添加回收率分别为96%、87%、85%；在水样中的添加回收率分别为103%、99%、116%，相对标准偏差(RSDs)在2.86%～8.86%之间，均小于15%。方法具有较好的准确性和重现性，符合《农药残留实验准则》的要求，可用于实际样品的检测。

表3 稻米、稻壳、植株、土样和水样中二甲四氯添加回收试验(n=5)

2.3 实际样品检测

按照1.2中所述二甲四氯残留分析方法对2013年9—10月采集于安徽省合肥市庐江县庐城镇、河南省新乡市原阳县祝楼乡、湖北省武汉市黄陂区王家河镇的水稻稻米样品进行检测，结果显示，从田间采集的6份水稻样品稻米中二甲四氯的残留量均低于最低检测浓度(0.02 mg·kg-1)，均未超出二甲四氯在稻米中的最高残留限量(MRL=0.05 mg·kg-1)。

3 结 论

本研究比较了不同的色谱检测条件，以及不同的提取方法，建立了适用于检测水稻及稻田环境样品中二甲四氯残留的高效液相色谱-串联质谱分析方法。该方法具有快捷、高效、重现性好、灵敏度高等优点。在添加浓度0.01～1.00 mg·kg-1范围内，样品添加回收率在85%～119%之间，RSDs在2.86%～8.86%范围，方法的LOQ为0.01～0.02 mg·kg-1，低于二甲四氯在稻米中的最高残留限量标准。对采集于安徽省合肥市、河南省新乡市、湖北省武汉市的六组稻米实际样品的检测结果表明，该方法具有良好的实际应用性，满足农药残留分析的要求。