人乳寡糖的分离分析

闫竞宇, 丁俊杰, 金高娃, 郭志谋, 梁鑫淼

中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室, 辽宁 大连 116023

糖是一类重要的生命活性物质，它不仅是细胞能量代谢的源泉，还常作为信号分子参与细胞的各种活动，例如分子识别、信号传导和免疫等过程。近年来，人体来源的低聚糖由于与人体健康息息相关而引起科研工作者的关注，从人体来源的庞大糖库中寻找有益的寡糖已经成为功能性寡糖研究的主要方向之一。在人源性寡糖中，来源于人乳中的低聚糖——人乳寡糖，由于其含量高、种类丰富并且与婴幼儿的生长发育息息相关而引起人们的重视。

人乳作为婴儿出生时唯一的食物来源，一方面其几乎含有婴儿必须的所有营养物质，如蛋白质、脂肪、碳水化合物以及微量的矿物质元素和维生素等，另一方面人乳对婴儿完善免疫系统、生长发育等方面具有重要的作用，而这些功能的实现与人乳中的寡糖组分密切相关[1～3]。人乳寡糖是人乳区别于其他哺乳动物乳汁的最主要成分，主要表现在：①人乳寡糖在乳汁中的含量是哺乳动物中含量最高的。1 L人乳中约含有5～20 g人乳寡糖，尤其在初乳中含量更高，1 L初乳中人乳寡糖可以达到20～25 g。而其他哺乳动物的乳汁相比较之下寡糖含量要低上百倍，例如在1 L牛奶中寡糖含量仅为0.03～0.06 g，山羊奶中寡糖含量为0.25～0.30 g，绵羊奶中仅含有0.02～0.04 g[4]。②人乳寡糖结构种类最多。丰富的种类也是人乳寡糖区别于其他哺乳类动物乳汁的重要特征。据预测人乳寡糖的种类可达到数百种，2010年日本学者Kobata[5]综述了近百种已发现的人乳寡糖结构，而目前所报道的牛乳、羊乳中寡糖仅有数十种[6]。③人乳寡糖结构组成同其他哺乳动物也有较大差异。人乳寡糖结构由5个基本糖单元组成，即葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、岩藻糖(Fuc)和唾液酸(N-乙酰神经氨酸-Neu5Ac)。这些寡糖一般在还原末端有一个乳糖，在乳糖的非还原端被不同数量的Galβ1-3GlcNAc (TypeⅠ) 或Galβ1-4GlcNAc (TypeⅡ) 单元分别以β1-3或β1-6方式延长成直链或支链寡糖结构(图1,彩图见图版一)。尤其值得注意的是人乳中所含有的唾液酸化寡糖组成是Neu5Ac，而其他哺乳动物的乳汁中如牛奶、羊奶中含有人体外源性的N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)，且人乳中岩藻糖化寡糖和唾液酸的量要远远高于其他哺乳类动物。正是由于人乳寡糖的差异性存在，使人乳变得非常“特别”，也使人乳成为婴儿配方奶粉不能企及的“黄金标准”。

图1 人乳寡糖结构示意图Fig.1 Schematic illustration of compositions and structures of HMOs.(彩图见图版一)

与牛乳和其他哺乳动物的乳汁相比，人乳寡糖的高含量和结构的多样性赋予了其一些特殊的生物学功能[7～9]。其中，人乳寡糖最为人熟知的功能是作为益生元调节婴儿肠道菌群。大多数的人乳寡糖不会被婴儿消化道消化，几乎全部以原型形式抵达小肠和结肠，在那里被某些益生菌如一些双歧杆菌所利用，从而促进这些益生菌的生长，同时人乳寡糖被肠道菌群利用代谢后，产生短链的脂肪酸，可降低婴儿肠道内的pH，抑制了致病菌如梭状芽胞杆菌、埃希氏大肠杆菌等的繁殖，进而维持肠道的微生态平衡，保护婴儿肠道健康。人乳寡糖另外一个重要的功能就是通过抗微生物黏附进而改善机体的防御功能。病毒、细菌等病原体侵入人体时首先要和宿主结合，最常见的方式为黏附上皮细胞表面受体，这些与病原体结合的受体多为糖复合物例如糖蛋白或者糖脂上的糖链，而人乳寡糖中的糖与这些受体在结构上非常相似，可以作为水溶性受体“引诱”病原体或致病菌与其结合从而被排出体外，实现了对机体的保护作用。例如含有1,2-岩藻糖的寡糖可以阻断空肠弯曲杆菌的黏附，也能中和大肠杆菌产生的耐热内毒素，从而降低这些因素引发的婴儿腹泻。

随着对人乳以及糖生物学研究的深入，人乳中糖类成分的功能逐渐被重视和发现，但想要进一步揭示其生物学功能，首先需要对其组成和结构进行全面的解析。近年来，国内外围绕人乳寡糖分离分析的研究工作逐渐增加，本文从人乳寡糖前处理、分离分析和结构表征三方面对当前主要研究进展进行了综述，以期为人乳寡糖结构与功能的深入研究工作提供参考。

1 人乳寡糖的预处理方法

人乳寡糖主要存在于乳清液中，通常的提取方法需要将母乳中的脂肪和蛋白质进行去除。脂肪的去除方法通常采用低温离心的方式，蛋白质主要采用有机溶剂沉淀，经过上述两步前处理过程后获得的乳清液主要含有乳糖和寡糖成分。乳糖和寡糖的结构性质类似，含量是寡糖的5～20倍，是对寡糖分析干扰最大的成分，通常需要一定的前处理方法对高含量的乳糖进行去除。

尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography, SEC)是分离人乳寡糖的传统技术，其分离过程是根据被分析物的分子体积大小及形状，按顺序被洗脱出色谱柱而达到分离的目的。人乳寡糖在SEC上的洗脱顺序依次为唾液酸化寡糖、聚合度从高到低的中性寡糖、乳糖。Asakuma等[10]采用Bio Gel P-2、DEAE Sephadex A-50和Bio Gel P-4依次对人乳寡糖样品进行纯化和粗分离，最后得到中性寡糖组分，衍生化后继续用反相色谱进行定量分析的方法，对日本人群中不同哺乳期8种中性寡糖含量变化进行了研究。由此可见使用 SEC 不仅可以去除乳糖，还可以实现寡糖的初步分离，在早期寡糖化合物纯化方面得到了广泛应用，但由于其处理的通量比较低，不适用于高通量的样品分析。

固相萃取(solid phase extraction, SPE)技术是应用最为广泛的样品前处理技术之一，具有高通量、易自动化、操作灵活等优点，石墨化碳是寡糖类样品预处理的常用固相萃取吸附材料。Lebrilla团队针对人乳寡糖设计了一个高通量SPE处理流程[11]，该流程同时实现了寡糖还原、脱盐、脱乳糖以及分离中性糖和酸性糖等目标，配合后面的纳升-液相芯片质谱分析(nano-LC chip)可以实现人乳寡糖的定性定量分析。近期本课题组发展了一种在线SPE亲水色谱质谱联用的方法(图2)，通过两种带有不同电荷的亲水色谱柱对寡糖的选择性差异，实现了人乳和其他哺乳动物乳汁中唾液酸化寡糖的分离分析，结果显示人乳同其他哺乳动物乳寡糖种类和含量具有巨大的差异性，该方法具有较高的检测灵敏度，更重要的是采用在线的前处理方法避免了繁琐的离线SPE处理过程，同时提高了方法的重复性和稳定性[12]。

图2 在线SPE-HILIC-MS分析的示意图[12]Fig.2 Schematic illustration of the online SPE-HILIC-MS[12].

除了上述几种常用的前处理方法，也有用膜分离技术等实现蛋白和乳糖去除，Karina等[13]使用纳滤膜技术对牛乳中的3’-SL、6’-SL和N-乙酰半乳糖胺化乳糖进行了富集，采用不同种类、分子量的膜对寡糖富集效果进行了考察，实现了从实验级放大到工业级的转化。Antonio等[14]采用两步膜技术对山羊乳寡糖进行纯化和富集，先采用超滤膜(截留分子量50 kDa)将大部分蛋白去除，然后，透过液采用纳滤膜(截留分子量1 kDa)除去盐、乳糖及小分子量的可溶性蛋白，得到的截留液即为寡糖馏分，最后使用HPAEC-PAD对山羊乳中的寡糖进行Profiling分析。膜分离技术在一定程度上存在乳糖去除不完全以及寡糖损失等缺点，限制了其应用。

2 人乳寡糖的分离分析方法

近年来随着研究者们对人乳寡糖的关注度增加，分离分析方法的报道也越来越多，如高pH阴离子交换色谱、石墨化碳液相色谱、亲水作用色谱、反相色谱、毛细管电泳等，本文就上述几种常用技术进行分别介绍。

2.1 高pH阴离子交换色谱(high pH anion exchange chromatography, HPAEC)

低聚糖是一种以半缩醛或半缩酮形式存在的多羟基醛或酮。在强碱性条件下, 会部分或全部以阴离子形式存在，从而在阴离子交换柱上被保留并得到分离。然而，传统的硅胶基质的离子交换色谱柱在强碱条件下非常不稳定，因而限制了其使用。近年来，发展的聚合物基质的离子交换色谱柱，在广泛的pH范围内，具有较高的机械和化学稳定性，促进了高效分离低聚糖和相关化合物技术的发展。HPAEC与脉冲安培检测器(pulsed amperometric detector, PAD)联用，其方法具有高分辨率、高选择性和低检测限的特点，该方法已被广泛应用于母乳寡糖的定性和定量分析，尤其是对寡糖异构体的分离[15～19]。寡糖经过凝胶柱将中性和酸性人乳寡糖预分离并去除乳糖后，采用HPAEC-PAD方法进行寡糖单体的分离分析，尤其是寡糖异构体可以得到很好的分离，该方法常用于对高含量的人乳寡糖进行定性定量分析。Thurl 等[15]使用HPAEC方法研究了不同人群和不同哺乳期寡糖含量变化情况，针对14种中性寡糖和6种非岩藻糖化的酸性寡糖进行分析，并利用德国哺乳期妇女3～90 d的母乳样本考察了哺乳不同时期和母亲血型对寡糖含量的影响。虽然HPAEC-PAD对人乳寡糖具有很好地分离选择性，但由于其前处理过程较为繁琐，并且其流动相体系不能直接和质谱联用，只能借助标准品对寡糖定性，一定程度上限制了 HPAEC的应用。

2.2 石墨化碳液相色谱(porous graphitized carbon chromatography, PGC)

石墨化碳液相色谱是一种常用于分离寡糖和糖结合物的分离方法，石墨化碳材料对寡糖能够很好地保留以及分离选择性，尤其是寡糖异构体。同时，PGC对还原性寡糖的α和β差向异构化也能够很好地区分，然而，这种分离容易导致图谱的复杂性，是不需要的分离性能，因此通常在PGC柱分离前，需要将还原性寡糖先进行还原。

Lebrilla和他的合作者广泛的将PGC用于HMOs的分析。他们发展了基于PGC前处理方法和HPLC PGC Chip/TOF MS的标准流程用于母乳寡糖的Profiling分析[11]。整个过程如下：母乳通过低温离心脱脂，有机溶剂沉淀除蛋白，得到脱脂除蛋白的母乳寡糖样品，使用硼氢化钠还原后，无孔石墨化碳SPE柱净化脱盐，得到母乳寡糖总馏分或母乳寡糖分级的馏分，再进行HPLC PGC Chip/TOF MS分析。同时，基于保留时间、精确分子量和质谱碎片信息，建立了一个包含40个中性寡糖和30个酸性寡糖的人乳寡糖数据库[20,21]。该方法广泛用于各种人乳寡糖轮廓分析中，如对不同哺乳期[22]、早产母亲[23]及分泌类型[24]，以及其他动物乳寡糖分析中，如灵长类[25]、猪[26]、牛[27,28]等。PGC-MS方法不仅应用于寡糖轮廓分析中，很多学者也利用此开展了人乳寡糖绝对定量分析[29,30]。鉴于人乳寡糖标准品难于获取，寡糖间性质接近，Lebrilla实验室采用少量标准品拟合虚拟标准曲线借此对其他寡糖定量分析，开展了对20个人群样本的49个寡糖的分析[31]。

2.3 亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)

亲水作用方法是解决极性化合物保留与分离的常用方法[32]，采用极性固定相和水溶性有机溶剂(主要为乙腈) -水为流动相，为强极性化合物如糖类化合物的分离分析提供了一个很好的选择。作为一种新型的色谱分离手段，HILIC克服了正相色谱和反相色谱在极性化合物分离过程中的不足，同时能够提供与反相色谱截然不同的分离选择性。此外，由于其流动相含有高浓度的有机溶剂，有利于增强电喷雾离子源质谱的离子化效率进而提高检测灵敏度，与质谱具有很好的兼容性。然而，HILIC用于人乳寡糖的分析还相对较少[33], 目前多用于动物乳寡糖分析[34～40]。一般在进行HILIC分析时，会对寡糖进行衍生化处理，来改善峰型、分离选择性(尤其是异构体)及检测灵敏度。2-氨基苯甲酰胺(2-AB)是应用较为广泛的衍生化试剂，Benet等[41]发展了一种在线去除剩余衍生化试剂的亲水色谱方法分析人乳寡糖，并将该方法用于对中国城市(北京、广州、苏州)母乳样本中的10种2-AB标记的HMOs进行了定量分析[42]，在最近的报道中他们用麦芽三糖作为内标物将检测的人乳寡糖的数量从10种扩展到20种[43]。

2.4 毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)及其他方法

毛细管电泳具有较高的分离能力和灵敏度，常被作为糖类化合物的分离和鉴定的一种有效分离工具[44～46]，结合荧光或者紫外检测器应用于衍生化的人乳寡糖分析中，也有研究者将其与质谱结合进行人乳和婴儿粪便中寡糖的检测。由于其分析的样品要求带有电性，所以较适用于唾液酸化寡糖的分析。Newburg[47,48]发展了一种CE-UV(205 nm)方法，并将其用于分离、鉴定和定量人乳中12种未标记的唾液酸化寡糖，结果显示具有较好的异构体分离效果。Monti等[49]利用相似的方法分析了不同动物(牛、羊和马)乳中唾液酸化寡糖。对于中性寡糖，由于不带电荷，不能直接进行CE分离，一般需要使用携带负电荷的发色团或荧光团物质进行衍生化，而唾液酸化寡糖进行衍生化后可以改善分析选择性和检测灵敏度，例如Galeotti团队[50]将寡糖使用2-aminoacridone进行衍生化后，采用CE-UV(254 nm)对人乳中17种中性和酸性寡糖进行了表征，一些寡糖异构体，如LST a、LST b和LST c，2’-FL和3-FL，LNFP I、LNFP II和 LNFP III能够被很好地分离。CE结合MS，不仅能够获得很好地分离，也能够获得寡糖的结构信息，包括寡糖异构体，可以用于人乳寡糖定量及轮廓分析。

除上述方法外，其他方法例如衍生化后的寡糖也可以经过反相色谱[51～53]进行分离，但是反相色谱对于寡糖异构体分离能力有限，使其应用受到了一定的限制。纸色谱、薄层色谱[54,55]和尺寸排阻色谱[56,57]是较早用于母乳寡糖分离分析的方法，这些方法在分离效率、检测灵敏度和异构体分离选择性上都存在一定的局限，现在已经逐渐被色谱柱与检测器联用方法所取代。

3 人乳寡糖结构鉴定技术研究

糖类分子的结构非常复杂，人乳寡糖的结构分析包括单糖组成分析、寡糖序列分析、岩藻糖和唾液酸修饰位点分析。20世纪80年代末期，基质辅助激光解析和电喷雾技术的发明，使有机质谱获得了突破性的进展，扩大了质谱的应用范围，也给糖类化合物的结构分析带来了较大的进展。核磁共振技术是化合物精确结构解析的最常用手段，但是受限于人乳寡糖单体获取较为困难，核磁共振技术需要的样品量较大，在一定程度上限制了其应用，本文就上述两种鉴定技术在人乳寡糖结构鉴定中应用进展进行了介绍。

3.1 基于质谱技术的结构表征

基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)除具有高灵敏度、快速、准确、高通量、易于实现自动化等特点外，同时还能耐受样品中不挥发性盐，不需要进行脱盐处理，简化了样品的操作过程。在离子化过程中，不易引起源内裂解，而形成准分子离子峰或准分子离子加和峰，可用于对人乳寡糖的单糖组成进行推断，也可以用于大量样本中快速的profiling分析。Berndt等[58]采用MALDI-MS对人乳中非衍生化的寡糖馏分进行了分析，在人乳中发现了聚合度大于20的酸性寡糖和聚合度大于35的中性寡糖，这些高聚合度寡糖的发现拓展了人们对人乳寡糖组成的认识。Kunz等[59]使用MALDI Q-TOF MS/MS方法，对大量母乳样本中寡糖种类进行分析，同时结合二级质谱碎片建立碎片结构与血型关系，从而开展高通量快速的样本轮廓分析。但MALDI-MS仅能给出糖的组成信息，不能够给出具体的连接位置及连接键信息，因此无法用于精确结构判断。

电喷雾质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)技术的出现，是生物大分子测定技术的重要突破。ESI显著优点是被分析物可以带多电荷，从而大大扩展了质谱的质量测定范围，不仅如此，电喷雾质谱的二级碎片结构还可以给出寡糖的连接顺序和连接键构型信息，因此常用于母乳寡糖定性定量分析及结构表征。Chai等[60,61]采用ESI-MS/MS负离子模式分别对人乳中中性和酸性寡糖进行质谱断裂规律表征，在这种模式下，寡糖不需要进行衍生化，就能够得到异构体的特征碎片信息，依据此可以鉴定唾液酸、岩藻糖的取代位置和寡糖的连接方式。Pfenninger等[62,63]对寡糖断裂规律进行了详细的综述。与中性寡糖相比，酸性寡糖的唾液酸基团在二级碎裂中容易脱落，由此产生的唾液酸碎片离子的信号强度非常高，与之相比，其他特征碎片的信号强度弱，给结构鉴定尤其是异构体的鉴定带来一定的难度。近期，郎银芝等[64]通过ESI-MSn方法对人乳寡糖高含量的8种酸性寡糖的解析进行了详细的介绍，为其他唾液酸寡糖的解析提供了参考。

3.2 核磁共振技术 (nuclear magnetic resonance,NMR)

核磁共振技术是20世纪中期发展起来的一种新技术，给糖结构解析工作带来了很多方便，特别是二维核磁共振技术的出现和发展, 使得 NMR 成为糖类结构解析的重要工具，在解决糖类化合物的糖苷键构型、糖的种类、糖残基数目、糖与糖的连接位置、糖与糖的连接顺序等方面具有重要的作用。NMR不需要标准品即可进行定性分析，这对于母乳寡糖中新的未知的糖定性分析具有显著地优势，但它对化合物的纯度要求较高，重量需在毫克级以上，在用NMR对化合物进行定性前，一般需要对目标化合物进行分离纯化。Chai等[65]结合ESI-MS和核磁共振技术对聚合度为10的不同人乳寡糖异构体进行结构解析，他们还采用相同的方法对一个聚合度为12的寡糖新结构进行了解析。

4 展望

尽管近年来人乳寡糖已建立较多的分析方法，从最开始的凝胶色谱和纸色谱相结合的方法，到高效阴离子交换色谱、毛细管电泳色谱，以及以石墨化碳为代表的反相色谱方法，这些研究多数以表征寡糖含量为目标，因此只是得到了寡糖的含量信息而没有获得高纯度的单体寡糖样品。与此同时，受限于人乳寡糖单体样品的获取问题，许多生物功能难于深入开展研究。而目前人乳寡糖单体尚缺少系统的制备方法，这与寡糖的分离方法局限和分离效率不高存在一定的关系，因此，人乳寡糖的分离纯化技术方面仍有较大的空间需要继续研究和探索。

谨以此文致敬中国科学院大连化学物理研究所七十华诞(1949-2019)!