红曲色素萃取发酵中表面活性剂的分离与重复利用

陈 功，吴振强*

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006）

红曲霉作为一种丝状真菌，可以发酵生产多种功能性代谢产物[1]。红曲色素作为红曲霉主要的聚酮类次级代谢产物，具有天然、营养、安全等潜在的价值，在亚洲国家广泛用于食品领域[2]。红曲色素种类较多，根据颜色一般分为红、橙、黄3 类。其中常见的红曲色素主要有6 种，包括两种黄色素（Y1：monascin、Y2：ankaflavin），两种橙色素（O1：rubropunctatin、O 2：m o n a s c o r u b r i n）及两种红色素（R 1：rubropunctamine、R2：monascorubramine）[3-4]。

红曲霉深层发酵主要代谢合成胞内色素，菌丝体内积累较多的脂溶性色素会导致反馈抑制，进而影响最终的色素产量[5-6]。渗透萃取发酵作为一种新型发酵技术，近年来广泛用于红曲色素的生产[6-7]。通过在发酵培养基中引入生物相容性较好的非离子表面活性剂Triton X-100（TX-100），能够增加细胞膜通透性，促进胞内色素跨膜分泌到胞外胶束溶液中，进而避免胞内色素反馈抑制，促进色素代谢，提高色素产量[8-11]。

红曲色素和表面活性剂的分离纯化是萃取发酵下游过程中的一个重要难题。有研究报道，使用乙醚直接一步法萃取分离红曲色素和TX-100，乙醚有机相中能回收较高含量的红曲色素，并且水相中的TX-100可以使用异丁醇进行回收[12]。Shen Lingjie等[13]通过离子液体[BMIm]PF6进行微乳液萃取分离，能够回收约80%的红曲黄色素（TX-100质量浓度未知），但离子液体价格较贵，不利于大规模萃取分离。近期，唐锐等[14]采用有机溶剂微乳液萃取和大孔树脂吸附联合分离方法，能够很好地将TX-100和红曲色素进行分离；最终黄色素的回收率达到64.5%，TX-100的去除率为97.47%；但此过程中红曲色素的分离特性及TX-100的回收利用没有深入研究。

在前期研究的基础上，进一步探索三氯甲烷萃取-大孔树脂吸附（trihalomethanes extraction combined with resin absorption，THMS-Resin）法分离萃取发酵液中红曲色素的相关特性；同时研究回收TX-100重复发酵的萃取性能；另外，考察回收TX-100共萃取发酵下红曲霉的生长和色素代谢情况；最后，研究TX-100多批次回收重复萃取发酵红曲霉生长和色素代谢特性，实现萃取剂的反复利用，提高萃取剂的利用价值和萃取发酵的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

用于发酵的红曲霉菌株Monascus anka GIM 3.592保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC/GIMCC）；S-8大孔树脂（强极性，粒径范围0.3～1.25 mm） 东鸿化工有限公司。[BMIm]PF6和[BMIm]BF4中国科学院兰州化学物理研究所；发酵、分离用试剂均为分析纯；液相色谱用试剂均为色谱纯；葡萄糖、鱼粉蛋白胨、硫酸铵、氯化钾 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ZWYR-D2402型摇床 海智城分析仪器制造有限公司；UV-2802S型紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；e2695高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（包括2998二极管阵列检测器和SunFire C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基制备

PDA培养基：马铃薯葡萄糖200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g；蒸馏水1 000 mL，培养基加热搅拌全部溶解后分装，121 ℃灭菌20 min。

种子培养基：葡萄糖20 g，鱼粉蛋白胨10 g，酵母提取物3 g，磷酸二氢钾4 g，氯化钾0.5 g，七水合硫酸铁0.01 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然，115 ℃灭菌20 min。

发酵培养基：葡萄糖50 g，硫酸铵5 g，磷酸二氢钾5 g，氯化钾0.5 g，七水合硫酸镁0.5 g，一水合硫酸锰0.03 g，七水合硫酸锌0.01 g，七水合硫酸亚铁0.01 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然，115 ℃灭菌20 min。

1.3.2 常规发酵和萃取发酵

菌种培养：保藏在-80 ℃的菌株M. anka GIM 3.592进行活化后，在PDA平板中进行划线，然后置于恒温培养箱中30 ℃培养7 d，培养后的种子平板4 ℃保存备用（一般不超过1 个月）。

种子培养：取培养7 d的PDA种子平板，加入6 mL 0.1 g/100 mL的Tween 80溶液洗脱红曲霉孢子，取3 mL菌悬液（孢子约106个/mL）接种到50 mL种子培养基中，180 r/min、30 ℃摇床培养28～30 h。

常规发酵培养：将培养好的种子液按8%（体积分数）接种量接种到25 mL发酵培养基中，180 r/min、30 ℃摇床培养7 d。

萃取发酵培养：参照常规发酵培养，在接种的同时向发酵培养基中添加40 g/L TX-100。

1.3.3 萃取发酵液中红曲色素与TX-100的分离

萃取发酵结束后，收集发酵液，8 000 r/min离心10 min，除去菌丝体，上清液用于胞外色素和TX-100分离。分离方法参考唐锐等[14]采用三氯甲烷萃取-碱性树脂吸附分离-甲醇洗脱色素的方式进行。

三氯甲烷萃取：向上清液中加入等体积的三氯甲烷，充分混匀；10 ℃、80 r/min振荡过夜，进行两相萃取；然后得到下层有机溶剂相，记录相应体积；同时检测有机相中TX-100质量浓度和色素含量，根据公式（1）和（2）分别计算三氯甲烷对色素和TX-100的萃取率：

式中：A为上清液中色素含量/AU；A1为两相萃取后有机相中色素含量/AU；V为上清液体积/mL；V1为两相萃取后有机相体积/mL。

式中：C为上清液中TX-100质量浓度/（mg/mL）；C1为两相萃取后有机相中TX-100质量浓度/（mg/mL）；V为上清液体积/mL；V1为两相萃取后有机相体积/mL。

碱性树脂吸附分离：S-8大孔树脂的碱性处理参考课题组之前的方法[14]。将碱性S-8树脂按照5 g/100 mL的比例，加入到三氯甲烷萃取分离后的有机相溶液中，30 ℃、200 r/min振荡吸附3 h；然后分离树脂，检测溶液中残留的TX-100质量浓度和色素含量，按照公式（3）和（4）分别计算碱性S-8树脂对色素和TX-100的吸附率：

式中：A0为树脂吸附前有机相中色素含量/AU；A1为树脂吸附后有机相中色素含量/AU。

式中：C0为树脂吸附前有机相中TX-100质量浓度/（mg/mL）；C1为树脂吸附后有机相中TX-100质量浓度/（mg/mL）。

甲醇洗脱树脂解吸色素：将上述吸附色素的树脂分离后，按照原比例（5 g/100 mL）加入含有1 g/100 mL HCl的甲醇洗脱剂，30 ℃、180 r/min振荡解吸1 h，共洗脱5次；按照公式（5）计算色素洗脱率：

式中：A0和A1为树脂吸附前、后有机相中色素含量/AU；V0为树脂吸附前后有机相体积/mL；A2为洗脱液中色素含量/AU；V2为洗脱液体积/mL。

1.3.4 不同方式回收TX-100重复萃取发酵

THMS-Resin法[14]：分离1.3.3节中碱性S-8树脂吸附后的有机相溶液，使用氮吹仪除去溶液中的三氯甲烷，获得TX-100，备用。

离子液体法[13]：向5 mL萃取发酵上清液中加入5 g离子液体[BMIm]PF6（或者[BMIm]BF4，具有较高亲水性、极性、高离子电荷、高介电常数等特性），充分混匀， 30 ℃水浴2 h，进行两相萃取；上相（TX-100）移入新的离心管中，65 ℃水浴进行浊点分离，获得TX-100，备用。

分别将上述方法（THMS-Resin、[BMIm]PF6、[BMIm]BF4）回收的TX-100以及新的TX-100进行萃取发酵，同时以常规发酵作为参考对照，考察菌体生长和色素代谢的差异。

1.3.5 新-旧TX-100不同比例复配重复萃取发酵

按照唐锐等[14]的方法回收萃取发酵液中的TX-100；将回收的TX-100（旧）和未使用过的TX-100（新）以1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1的比例进行复配，重复萃取发酵，考察新-旧TX-100不同比例复配萃取发酵对菌体生长和色素代谢的影响。

1.3.6 TX-100多批次回收重复萃取发酵

按照唐锐等[14]的方法，从原始萃取发酵液中回收得到的TX-100定义为第1次回收，将第1次回收的TX-100萃取发酵定义为第1次重复萃取发酵；然后进行第2次回收和第2次重复萃取发酵；依次进行到第5次回收和第5次重复萃取发酵；考察每次重复萃取发酵红曲霉菌体生长和色素代谢情况。按式（6）、（7）计算各批次回收TX-100进行红曲霉萃取发酵的胞外、胞内色素相对含量表示萃取效率和代谢能力，按式（8）计算TX-100回收率：

式中：A0为新TX-100萃取发酵胞外色素含量/AU；Ax为各批次旧TX-100萃取发酵胞外色素含量/AU。

式中：B0为新TX-100萃取发酵胞内色素含量/AU；Bx为各批次旧TX-100萃取发酵胞内色素含量/AU。

式中：Cy为各批次萃取发酵液中回收TX-100质量浓度/（mg/mL）；Cx为各批次萃取发酵液中投入TX-100质量浓度/（mg/mL）。

1.3.7 指标测定

菌体量测定采用质量法[15]；残糖含量测定采用3,5-二硝基水杨酸法[16]；清除DPPH自由基能力检测参考Bei Qi等[17]的方法，以VC计（mg/g）。

TX-100质量浓度测定：样品用甲醇适当稀释后，使用HPLC法检测TX-100质量浓度。色谱条件：2998二极管阵列检测器，C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，进样量10 μL，流动相甲醇，流速1.0 mL/min，检测波长277 nm[14,18]。

红曲色素含量测定：采用UV-2802S紫外-可见分光光度计测定不同样品中的色素含量，以410、470、510 nm波长处的吸光度（AU）乘以稀释倍数分别作为混合色素中黄色素、橙色素、红色素的含量[5,6,8-16,19]。

红曲色素组分测定：采用HPLC检测样品中色素组分[20]，色谱系统包括Waters e2695分离系统和Waters 2998二极管阵列检测器检测系统；色谱柱为Sunfire C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃；样品进样体积10 µL；流动相包括A相（超纯水，添加0.3%磷酸）和B相（乙腈）；洗脱流速1.000 mL/min，采取梯度洗脱（0 min，80% A；25 min，20% A；35 min，20% A；36 min，80% A；40 min，80% A），洗脱时间40 min；二极管阵列检测器检测波长200～600 nm记录色素光谱，提取色谱图波长410 nm[21]。

2 结果与分析

2.1 有机溶剂萃取-树脂吸附分离特性

表1 THMS-Resin法分离萃取发酵液中黄色素和TX-100Table 1 Separation of yellow pigment and TX-100 from the extractive fermentation broth by the THMS-Resin method

采用THMS-Resin法分离红曲霉萃取发酵液中的红曲色素和TX-100，结果如表1所示。起始的萃取发酵液中黄色素含量为93.78 AU，TX-100质量浓度为38.40 g/L。三氯甲烷萃取后，大部分黄色素和TX-100被萃取到三氯甲烷有机相中；通过检测计算，有机相中黄色素萃取率达到81.77%，TX-100萃取率达到90.71%。说明三氯甲烷具有很好的色素和TX-100萃取回收能力，但选择性很差，不能很好的将二者分开。大孔树脂由于具有孔径结构和表面功能基团多样性的特性，被广泛用于吸附分离不同分子质量的化合物[22-23]。S-8树脂是一种苯乙烯型极性共聚体大孔树脂，能够通过静电相互作用吸附极性物质[24]。通过碱性S-8树脂吸附三氯甲烷萃取液，检测发现树脂吸附的黄色素含量为65.12 AU（吸附率84.91%），吸附的TX-100质量浓度为0.91 g/L（吸附率2.61%）。树脂的吸附能力与自身极性、孔径孔穴大小、比表面积有很大的关系，经过酸碱处理可以改变树脂表面功能基团的电荷极性，进而影响对目标物质的选择性吸附效果[25]。说明碱性S-8树脂能够很好地将色素和萃取剂分开，TX-100留在三氯甲烷萃取液中，进而可以通过除去三氯甲烷回收TX-100。这一结果与唐锐等[14]的研究基本一致，同时解释了萃取吸附原理，即三氯甲烷可能破坏萃取发酵液中TX-100-色素混合胶束结构，导致色素从胶束中释放到有机相；碱性S-8树脂进而选择性吸附有机相中游离的色素，实现色素与TX-100的分离。进一步通过盐酸-甲醇洗脱树脂吸附的色素，结果显示，5 次洗脱后的黄色素和TX-100的总洗脱率分别达到74.90%和61.58%；总洗脱液中黄色素含量为48.77 AU，TX-100质量浓度为0.05 g/L。说明通过此方法可以很好地分离萃取发酵液中的萃取剂和红曲色素，最终获得几乎不含TX-100的较高含量的黄色素。

图1 THMS-Resin法分离过程中色素的HPLC图谱（A）和DPPH自由基清除能力（B）Fig. 1 HPLC chromatogram (A) and DPPH radical scavenging capacity (B) of pigment separated by the THMS-Resin method

通过HPLC检测上述THMS-Resin分离过程中色素组分变化情况，图1A结果显示，萃取发酵液中含有多种色素成分，除了原有的胞内外色素组分外[26]，还出现一些新的色素成分；鉴定发现，有4 种新的黄色素在萃取分泌过程中通过酶催化橙色素（O1：rubropunctatin、O2：monascorubrin）转化而来[27]。经过三氯甲烷萃取后，萃取液中色素组分几乎没有改变，但单个色素峰谱图更加清晰；说明三氯甲烷很好地将色素萃取出来，进而分离除去发酵液中的一些杂质。碱性S-8树脂吸附三氯甲烷萃取液后，发现只有部分色素（Y1：monascin）残留在萃取液；说明大量的色素被吸附到树脂中，体现了S-8树脂的强大吸附能力。经过酸性甲醇溶液洗脱树脂中的色素，发现洗脱液中含有较多的黄色素，其中包括一些新的色素成分。说明通过上述分离方法最终可以获得较高含量的黄色素。

有研究报道，红曲黄色素具有一定的生物活性功能，例如抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗肥胖、抗炎[28-29]。通过检测THMS-Resin分离过程中色素的抗氧化活性，图1B结果显示，与常规发酵（空白）相比，萃取发酵胞外色素具有更高的DPPH自由基清除能力，说明萃取到胞外的色素具有很强的抗氧化活性。通过三氯甲烷萃取后，除去了发酵液中的一些杂质，获得较纯的色素，导致DPPH自由基清除能力进一步提高。碱性S-8树脂吸附三氯甲烷萃取液色素后，剩余萃取液的DPPH自由基清除能力显著下降，说明大量的功能活性色素被树脂吸附。进一步检测洗脱液中色素的DPPH自由基清除能力，发现抗氧化活性能力达到较高水平，说明分离纯化后的红曲色素具有很高的抗氧化活性。所以，采用萃取发酵技术，分离分泌到红曲霉胞外的色素具有潜在的抗氧化活性功能，可能来自于这些新的黄色素成分。

2.2 不同方法回收表面活性剂重复用于萃取发酵

图2 不同方法回收TX-100重复萃取发酵细胞生长（A）和色素代谢（B）情况Fig. 2 Cell growth rates (A) and pigment metabolism (B) in extractive fermentation with the recycled TX-100 by different methods

萃取剂的回收率和回收溶液中含有的杂质成分，在重复发酵时会影响红曲霉细胞的生长和色素的萃取效率。通过不同方法回收TX-100进行重复萃取发酵，结果如图2所示。[BMIm]BF4法回收的TX-100重复萃取发酵，葡萄糖利用很少，菌体生长缓慢，几乎没有色素产生。可能是[BMIm]BF4法回收的TX-100溶液中含有一些残留的离子液体，在红曲霉萃取发酵过程中对细胞毒性较大，抑制了细胞的生长和色素代谢。相反，采用[BMIm]PF6和THMS-Resin法对回收的TX-100进行重复发酵表现出较好的生物相容性；葡萄糖几乎完全利用，菌体量与正常TX-100萃取发酵相比差别不大，最终均可达到9 g/L左右，并且THMS-Resin法略高于[BMIm]PF6法；但相对于常规发酵（空白），萃取发酵的菌体量均有所下降，说明萃取剂对细胞生长具有一定的抑制作用（图2A）。另外，采用[BMIm]PF6和THMS-Resin法对回收的TX-100进行重复萃取发酵，可以获得跟正常TX-100萃取发酵相近的总色素含量，且高于常规发酵，进一步说明萃取发酵可以显著提高红曲色素产量。相比[BMIm]PF6法，采用THMS-Resin法对回收的TX-100进行红曲霉重复萃取发酵，胞外色素含量相对较多（图2B），说明THMS-Resin法回收的TX-100没有降低萃取能力，可以用于重复进行红曲霉萃取发酵，提高色素产量。

2.3 回收表面活性剂部分替代萃取发酵

图3 新-旧TX-100不同比例共萃取发酵细胞生长（A）和色素代谢（B）情况Fig. 3 Cell growth rates (A) and pigment metabolism (B) in extractive fermentation with new and recycled TX-100 in different proportions

采用THMS-Resin法对回收的TX-100（旧）和未使用过的TX-100（新）以不同比例混合后进行萃取发酵，结果如图3所示。新-旧TX-100不同比例混合萃取发酵均表现出很好的生物相容性，发酵7 d后葡萄糖基本耗尽，菌体量均达到9 g/L左右；但新TX-100比例相对较高时（＞1∶1），细胞生长抑制相对加强，最终菌体量略有减少（图3A）。采用新-旧TX-100不同比例进行红曲霉混合萃取发酵，总色素含量均可以达到160 AU以上，说明红曲霉均能很好地代谢色素。而采用新-旧TX-100高比例（＞1∶1）混合萃取发酵时，胞内外色素含量均相对较高，从而获得较高的总色素含量。说明通过回收的旧TX-100部分替代新TX-100萃取发酵，可以促进红曲霉胞内外色素的代谢与分泌，可能由于回收的旧TX-100胶束中含有少量的微量元素，在重复萃取发酵过程中促进细胞生长和色素代谢。研究显示，红曲色素液态发酵过程中，一些金属离子包括Fe2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+等对色素代谢有很大的调控作用[4,30]。因此，采用新-旧TX-100协同发酵可以在一定程度上减少细胞伤害，促进色素代谢，同时提高色素萃取效率，获得较高的色素产量。

2.4 多批次回收表面活性剂重复萃取发酵

TX-100经过5 次反复回收和重复萃取发酵，每批次的红曲霉细胞均能很好地生长代谢，菌体量均维持在8～11 g/L之间，说明TX-100多次重复利用均具有很好的生物相容性。值得注意的是，使用各批次回收的TX-100重复萃取发酵获得的菌体量比正常萃取发酵略高，相对生长率（旧TX-100萃取发酵菌体量/新TX-100萃取发酵菌体量）均达到1.0以上（表2）。可能由于TX-100批次利用会降低回收的相对含量，进而减少对细胞的毒性和抑制，促进红曲霉菌体生长；同时说明各批次回收的TX-100可以重复用于萃取发酵。

表2 TX-100多批次回收重复萃取发酵细胞生长和色素代谢情况Table 2 Cell growth rates and pigment metabolism in extractive fermentation with the recycled TX-100 from multiple batches

从色素代谢产量来看，各批次回收的TX-100重复萃取发酵均能获得较高的总色素含量。与正常萃取发酵相比，各批次回收的TX-100重复萃取发酵可以获得相同含量的胞外色素，尤其是胞外黄色素相对含量达到1.0以上；同时，胞外橙色素和红色素相对含量分别达到0.9和0.8以上（表2）。通过计算，5 次重复萃取发酵TX-100的回收率均达到80%左右（图4），说明采用回收的TX-100进行红曲霉重复萃取发酵，表现出很好的胞外色素萃取能力，可能与较高的TX-100回收率有关；同时，胞内黄色素相对含量为0.6左右，可能由于回收的TX-100溶液中含有一定的残余色素和抑制物质，进而影响了胞内色素的代谢。

图4 TX-100多批次重复萃取发酵回收率Fig. 4 Recovery of TX-100 from multiple batches

图5 TX-100多批次回收重复萃取发酵胞内外色素可见光谱和HPLC图谱Fig. 5 Visible spectra and HPLC chromatograms of intracellular and extracellular pigments in extractive fermentation with the recycled TX-100 from multiple batches

5 次重复萃取发酵，各批次胞外色素光谱基本一致，最大吸收峰在430 nm左右，但胞内色素最大吸收峰从470 nm向410 nm转移，说明胞内色素特性发生变化（图5A、B）。通过HPLC分析发现，5 次重复萃取发酵胞外色素组分和相对比例基本一致，但胞内黄、橙色素相对比例有所差异，与光谱图结果一致（图5C、D）。说明采用回收的TX-100进行红曲霉重复萃取发酵可能改变了胞内的色素代谢调控水平，进而影响了胞内色素产量。分析第5次重复萃取发酵液中红曲色素和TX-100的分离结果，发现利用THMS-Resin法同样可以回收51.78%的黄色素和78.61%的TX-100。同时，分离过程中红曲色素组分的HPLC谱图与图1基本一致，说明通过THMSResin法能很好地实现TX-100和红曲色素的分离；回收的TX-100可以很好地重复用于萃取发酵，获得较高含量的红曲色素，尤其是黄色素。

3 结 论

采用THMS-Resin法可以分离出红曲霉萃取发酵液中的TX-100和红曲黄色素，回收率分别达到78%和52%左右；最终获得的红曲色素中含有大量的新黄色素成分，同时具有显著的抗氧化活性。采用THMS-Resin法回收的TX-100进行红曲霉重复萃取发酵，细胞生长良好，同时萃取剂保持较好的色素萃取性能，优于[BMIm]PF6和[BMIm]BF4法。采用新-旧TX-100进行协同萃取发酵，可以显著促进胞内外色素代谢分泌；其中新-旧TX-100比例4∶1时，胞内外总色素产量提高最为明显，达到35%左右。连续5 次采用回收的TX-100进行重复萃取发酵，红曲霉生长稳定，细胞生长量高于正常萃取发酵水平；胞外色素相对含量均达到0.8以上，其中黄色素达到1.0；同时，胞内色素代谢能力能够维持在相对含量0.6以上；另外，5 次重复萃取发酵TX-100回收率均达到80%左右。因此，THMS-Resin法能够很好地实现萃取剂和红曲色素的分离，回收的TX-100可以多次回用，为萃取发酵的生产应用提供参考。