不同NaCl浓 度条件下亚麻籽胶对肌原纤维蛋白凝胶作用力及乳化特性的影响

冯美琴，刘雯燕，孙 健,*，徐幸莲，周光宏

（1.金陵科技学院动物科学与技术学院，江苏 南京 210038；2.南京农业大学食品科技学院，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏 南京 210095）

肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）作为肌肉中的结构蛋白质群，除了影响肌肉的收缩及嫩度外，它也是参与乳化的主要物质，并且其受热形成的凝胶对乳化肉制品的质构、黏着性、保油保水性和出品率有直接的影响[1]。因此，MP在重组肉制品和糜类肉制品加工过程中起着重要作用[2]。另外，MP乳化凝胶作用受其理化性质的影响，例如肌肉类型、蛋白质浓度、温度、pH值和离子强度，同时受其他添加物的影响。其中，食盐是肉类加工过程中必需的辅料之一[3-4]，它可以改善肉制品的保水保油能力，产品质构以及感官品质[5]。Whiting[6]研究发现在法兰克福香肠中降低NaCl含量可以增加脂肪和水在蒸煮过程中的损失。吴菊清[7]研究发现低盐条件会影响MP乳化物及乳化凝胶的水分分布，降低凝胶保水性。据报道[8]食盐的过多摄入会影响人类健康。因此在实际生产中，常常通过添加亚麻籽胶（f l axseed gum，FG）等亲水胶体改善低盐条件下造成的肉制品品质劣变。

FG是从亚麻籽中提取的一种阴离子多糖，具有良好的胶凝、发泡、乳化、保水和流变特性。Chen Haihua等[9]研究FG与肉蛋白间相互作用，发现添加FG能够显著提高蛋白质的热变性温度，并且增加保水性和硬度。孙健[10]研究发现添加FG的猪肉MP凝胶结构变得更加致密连续。Feng Meiqin等[11]研究发现MP的保水性随着FG的添加量的提高而增强。MP热诱导凝胶的功能特性（比如凝胶保水性）主要取决于化学作用力[12]。目前报道主要集中于单一理化条件下对MP的影响，本实验创新性地通过在不同NaCl浓度条件下加入FG研究其能否提高低浓度NaCl条件下的乳化凝胶特性。另外，以猪油为油相模拟简单的肉糜体系研究FG-MP的乳化作用也鲜见报道。

本实验在不同NaCl浓度条件下，研究FG-M凝胶的作用力（离子键、氢键、疏水相互作用、二硫键和非二硫键）和FG-MP凝胶的作用机理，同时以猪油为油相研究FG-MP乳液的乳析指数、脂肪微粒粒度分布、ζ-电位以及显微观察研究NaCl浓度对FG-MP乳化体系稳定性的影响，从而确定FG对MP乳化凝胶的作用机制，促进FG在肉制品中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宰后24 h（pH 5.6～5.8）的猪肉背最长肌，购于南京苏果超市；猪背膘熬制，用纱布过滤得到猪油，真空包装，置于-20 ℃保存。

FG（纯度99.8%，含有16.09%蛋白质、5.10%水和4.35%灰分） 新疆绿旗公司；氯化钠、氯化钾、氯化镁、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、Triton X-100、酒石酸钾钠、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、牛血清白蛋白、三羟甲基氨基甲烷-盐酸、乙二胺四乙酸二钠、甲醇、十二烷基硫酸钠、尿素、碳酸钠、硫酸铜等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Ultra-Turrax T25 basic数显型高速分散机 德国IKA公司；AR64型高速冷冻离心机 美国Beckman-Coulter公司；M2e多功能酶标仪 美国MD公司；AUY120型天平 日本岛津公司；Worcestershire激光粒度分析仪、Nano ZS90电位仪 英国Malvern公司；DP12倒置显微镜日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

参照Han Minyi等[13]的方法并进行改进。称取100 g肉，用绞肉机搅碎后，加入400 mL pH值为7.0提取液（其中含20 mmol/L K2HPO4-KH2PO4、100 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸）于1 000×g离心10 min后收集沉淀，重复2 次，期间用匀浆机处理30 s。然后向离心后的沉淀中加入400 mL提取液，再加入4 mL Triton X-100，充分混匀后1 500×g离心10 min，再向沉淀中加入400 mL 0.1 mol/L KCl溶液，1 500×g离心10 min收集沉淀，重复2 次。最后沉淀加入400 mL去离子水，1 500×g离心10 min收集沉淀，重复2 次。由以上操作得到无盐的MP，用双缩脲法测其蛋白质量浓度，密封置于4 ℃保存备用。上述过程均在4 ℃条件下进行。

将提取的蛋白分别溶于含有不同浓度的NaCl（0、0.2、0.4、0.6 mol/L）的磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4，pH 6.5）中，根据实验要求配制相应浓度的MP溶液，置于4 ℃保存备用。

1.3.2 FG-MP凝胶的制备

将FG与猪肉MP用匀浆机混合均匀，使MP最终质量浓度为40 mg/mL，加入质量分数0.4% FG。将配好的样品放入水浴锅，以约1 ℃/min的速率从20 ℃升温到70 ℃，保温30 min。冷却后测定相关指标。

1.3.3 FG-MP复合凝胶体系分子间相互作用力测定

有轨电车联通线类似于地铁联络线，但又不同于地铁联络线。有轨电车要实现网络化运营，需在联通运营的线路之间设置联通线。联通线宜采用互通道岔连接，由于多条线路在此交汇运营，在一定行车密度下不同运营线路的车辆可能同时到达，因此，接轨站站位和配线的设计应结合信号控制需求，以保障车辆不会由于排队而影响交叉口的正常通行为准则。

参照兰冬梅[14]的方法，称取凝胶样品3 g，加S1（0.6 mol/L NaCl，30 mL），用5 000 r/min匀浆2 min，然后放置1 h，10 000×g离心25 min后上清液保存。离心后的沉淀加S2（0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素，30 mL），重复上述步骤，将沉淀继续加S3（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素，30 mL），重复上述步骤，向沉淀加S4（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/L β-巯基乙醇，30 mL），重复上述步骤，最后所得的沉淀加2 mL 1 mol/L NaOH溶液保存。并且所得的所有上清液分别加入相同体积的20%三氯乙酸溶液，5 500×g离心15 min，取其沉淀，向沉淀中加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液保存，然后用Lowry法测定蛋白质的含量。上述过程均在4 ℃条件下进行。其中，S1蛋白含量代表离子键，S2蛋白含量代表氢键，S3蛋白含量代表疏水相互作用，S4蛋白含量代表二硫键，S4离心后沉淀的蛋白含量代表非二硫共价键。

1.3.4 乳化液的制备

FG添加量是依据前期研究结果[15]所得，研究发现添加质量分数0.4% FG条件下，乳液能够保持相对稳定，并且在低离子强度（0、0.2 mol/L NaCl）条件下没有发生乳析现象。

将质量分数0.4% FG溶解于0、0.2、0.4、0.6 mol/L不同浓度NaCl的MP溶液中，使MP最终质量浓度为10 mg/mL。再分别将含有FG和不含FG的MP溶液中加入10%猪油，8 000×g匀浆制成乳状液。上述过程均在40 ℃条件下进行。准备的乳化液要在24 h之内使用。

1.3.5 乳化稳定性的测定

将待测样品置于玻璃试管（1.0 cm×15 cm）中，在常温条件下静置3 h及30 d记录乳析界面高度的变化。乳析指数按下式计算：

式中：Hs为清液的高度/cm；Ht为乳化液的初始高度/cm。

1.3.6 ζ-电位的测定

1.3.7 脂肪微粒粒度分布测定

参考Ahmed等[16]的方法并进行修改。其中，颗粒折射率为1.520，分散剂为水，分散折射率为1.330，颗粒吸收率为0.001，分析模式为通用球形，进样器名为Hydro 2000 MU(A)，噪音为30 s。采用Mastersizer 3000型激光粒度分析仪进行测定，得到脂肪微粒粒度分布图谱。数据结果用平均粒径D4,3表示。

1.3.8 光学显微镜

乳液的微结构研究使用光学显微镜观察。将乳液滴到载玻片上并用盖玻片覆盖。使用显微镜数字照相机（OlympusDP12，Tokyo，Japan）连接到软件（Olympus DP12，Tokyo，日本）安装在计算机上。

1.4 数据统计分析

每个实验重复3 次，采用SAS 9.2统计软件计算。采用Duncan’s multiple range test程序分析平均值和差异，并在显著性水平P值小于0.05时进行单因素方差分析和t检验，评估样本组之间的差异。

2 结果与分析

2.1 不同NaCl浓度条件下FG对MP凝胶体系分子间相互作用力的影响

图1 不同NaCl浓度条件下FG对MP凝胶体系分子间相互作用力的影响Fig. 1 Effects of different NaCl concentrations and FG on the chemical interactions of MP gel

如图1所示，MP凝胶中疏水相互作用、二硫键以及非二硫共价键所占的比例较大，而离子键和氢键所占比例较小。兰冬梅[14]在研究罗非鱼肌肉蛋白凝胶过程中也发现了类似的结果。随着NaCl浓度的提高，可以看出二硫键和非二硫共价键的含量是随之升高的（P＜0.05）。并且当NaCl浓度达到0.6 mol/L时，在不含FG的MP凝胶中二硫键含量是最高的。关于疏水相互作用，不含FG的MP凝胶出现了先升高后降低的现象，在0.2 mol/L NaCl条件下达到最大。而在实验范围内，离子键和氢键的含量无显著变化（P＞0.05）。另外，相对于对照组，FG-MP凝胶的作用力随着NaCl浓度的变化相对平稳。

研究FG和MP间的化学作用力可以对FG在肉制品的应用具有更好的指导作用。随着MP凝胶的形成，MP分子开始变性并有序聚集，形成三维网状结构，而最终体系中蛋白分子的相互作用力会达到一种新的平衡状态[17-18]。其中，蛋白分子间的相互作用力主要包括离子键、氢键、二硫键、疏水相互作用、非二硫共价键等[19]。在凝胶形成的前期，离子键和氢键开始断裂，蛋白变性，疏

水基团和活性巯基开始外露[20]。在热处理过程中，疏水基团和活性巯基逐渐从分子内部暴露，体系产生疏水相互作用，造成肌球蛋白分子聚集[21]。而此时活性巯基发生氧化或—SH/S—S交换反应[22]，形成二硫键。与此同时，非二硫共价键也开始形成[23]，最终形成凝胶的网络结构。随着NaCl浓度的提高，二硫键和非二硫共价键的含量随之升高（P＜0.05），这主要与MP的盐溶性有关。从图1可以看出，MP凝胶中疏水相互作用、二硫键以及非二硫共价键所占的比例较大，而离子键和氢键所占比例较小。这说明形成凝胶体系的关键是二硫键和非二硫共价键的贡献。而离子键与氢键不是维持MP凝胶及FG-MP凝胶稳定构象的主要化学作用力。据报道，这可能是由于在凝胶形成过程中，离子键和氢键参与肌球蛋白分子尾部的缠绕，而不参与头部的聚集[24]。

2.2 不同NaCl浓度条件下FG对MP乳液乳析指数的影响

图2 不同NaCl浓度条件下FG对MP乳液3 h（A）和30 d（B）乳析指数的影响Fig. 2 Effects of different NaCl concentrations in the absence and presence of FG on the creaming index of emulsions with MP at 3 h (A) and 30 d (B)

乳析指数可以从宏观角度表征乳液的乳化稳定性，乳析指数越低，说明乳化液越稳定。从图2可以看出，MP乳液受NaCl浓度的影响显著（P＜0.05），并且随着NaCl浓度的提高，乳析指数显著降低，乳液更加稳定。如图2A所示，NaCl浓度为0、0.4、0.6 mol/L时，乳析指数为56%、18.67%、16.67%。这可能是由于盐离子增大了MP的溶解度，使MP更好地包裹在油滴表面，从而提高了乳化稳定性[25]。贾娜等[26]也报道了相似的现象，研究发现MP-混合食用胶乳液在低盐条件下，随着盐浓度的提高，乳化稳定性也随着增加。值得注意的是，FG-MP乳液不受NaCl浓度的影响，并且在贮存期间没有发生乳析现象（P＞0.05），一直保持稳定状态。FG添加到MP乳液后，具有乳化作用的FG包裹在油滴表面或者部分FG包裹在MP膜的表面，使油滴更加稳定。并且据Wang Meng等[27]研究报道，FG还可以增强流动相的黏度，降低油分子的运动，防止其碰撞造成乳液的絮凝。另外，对比图2A、B可以发现，当乳液放置30 d后，MP乳液在0.4 mol/L和0.6 mol/L NaCl条件下乳析指数明显升高，即乳化稳定性明显降低。如0.2 mol/L NaCl条件下，乳液的乳析指数从48%升高至54.7%，而0.4 mol/L NaCl条件下，乳液的乳析指数从18.67%升高至43.7%。这说明高浓度NaCl条件下，MP乳液受贮藏时间影响较大。这可能是由于高浓度NaCl条件下，静电斥力的减小使得乳化颗粒更容易聚集形成大颗粒，从而发生乳析现象。

2.3 不同NaCl浓度条件下FG对MP乳液ζ-电位的影响

图3 不同NaCl浓度条件下FG对MP乳液ζ-电位的影响Fig. 3 Effects of different NaCl concentrations in the absence and presence of FG on the zeta potential of emulsions with MP

含有10%猪油的乳化液在不同NaCl浓度条件下电位的变化，如图3所示。在实验范围内，所有乳化液都处于负电荷状态。FG-MP乳液比MP乳液电位的绝对值更大，这可能与FG是阴离子多糖有关[28]。而MP乳液的电位值比FG-MP乳液受NaCl浓度的影响更大，这与图1中乳析指数的结果相一致。并且对于MP乳化液，随着NaCl浓度的提高，电位的绝对值逐渐减少（P＜0.05），在0.6 mol/L NaCl达到最小值。而对于FG-MP乳液，其电位的绝对值随着NaCl浓度的提高略有升高（P＞0.05）。表面电位是用于评价乳化稳定性的重要参数。电位的绝对值越大则说明油滴之间的静电斥力越大，防止油滴聚集成大颗粒，有助于乳化液的稳定性。结果表明，Na+浓度不对FG-MP乳液的稳定性起着重要的作用（P＞0.05）。这可能是由于FG包裹在MP表面，使其受NaCl浓度的影响较小。Abdolmaleki等[29]报道了类似的结果，研究发现NaCl浓度对黄蓍胶乳液稳定性没有显著影响。而在MP乳化液中，MP受NaCl浓度影响较大（P＜0.05）。据悉，羧基在蛋白质分子外围非常活跃，创造一种阴离子环境[30]。随着盐加入到乳液中，Na+与羧基基团结合，从而导致负电荷减少。

2.4 不同NaCl浓度条件下FG对MP乳液粒径的影响

图4 不同NaCl浓度条件下FG对MP乳液粒径D4,3的影响Fig. 4 Effects of different NaCl concentrations in the absence and presence of FG on the particle size (D4,3) of emulsions with MP

如图4所示，含有FG的乳液微粒粒径均高于不含FG的乳液微粒粒径。并且含有FG的乳液微粒的粒径随NaCl浓度的增高略有降低，但是变化不显著（P＞0.05），可能与多糖受NaCl影响较小有关[29]。而不含FG的MP乳液的粒径受NaCl浓度的影响显著（P＜0.05）。随着NaCl浓度的增加，D4,3呈现了先减小后增大的趋势，在0.4 mol/L NaCl条件下，颗粒粒径达到最小值。其趋势与前人研究结果相似[31]。这可能是因为MP的溶解度随着NaCl浓度的提高而增大，使得更多的MP包裹在油滴表面，导致油滴粒径的降低。但是当NaCl浓度提高到一定值，静电斥力的降低使得油滴靠近，从而形成更大的粒径。

2.5 MP乳液及FG-MP乳液的显微观察结果

图5 MP乳液和FG-MP乳液在不同浓度NaCl条件下的微观图Fig. 5 Light micrographs of emulsions containing MP and FG

由图5可以看出，猪脂肪颗粒被分散成球状油滴分散在连续相中，并且颗粒大小与图4结果基本一致。不含FG的MP乳液随着NaCl浓度的增加，颗粒大小呈现了先减小后增大的趋势，在0.4 mol/L NaCl条件下，颗粒粒径达到最小值。含有FG的乳液微粒的粒径随NaCl浓度的增高，变化不明显。并且发现，虽然不含FG的乳液粒径小于含有FG的乳液粒径，但是出现了相互聚集的趋势。这可能与电位有关，静电斥力减少，使得颗粒相互靠近，出现了聚集的现象。

3 结 论

本实验通过凝胶作用力的测定发现维持MP凝胶及FG-MP凝胶稳定构象的关键是二硫键和非二硫共价键的贡献。另外，通过测定乳液的相关指标发现虽然MP乳液随着NaCl浓度的提高，乳化稳定性得到明显提高，但是在高浓度NaCl条件下容易受到贮藏时间的影响。而FG-MP乳液在所有NaCl浓度范围内均没有发生乳析现象，尤其是低浓度NaCl条件下FG-MP乳液的稳定性显著高于MP乳液。相对于对照组，添加FG的MP乳液的电位值和粒径大小受NaCl浓度变化不显著，说明FG可以抵抗NaCl浓度的变化对电位及粒径的影响。显微观察发现FG的加入可以改善MP乳液出现的液滴聚集的现象。这说明添加FG可以显著提高MP乳液的乳化稳定性，并且能够大大提高其抗盐能力。因此，可以在实际生产应用中通过添加FG，改良肉制品品质，减少食盐摄入量，达到促进人体健康的目的，为低盐肉制品的开发提供了一定的理论依据。