PAI-1(4G/5G)和ABCB1 C3435T基因与狼疮继发股骨头坏死的相关性

李思佳,张 葵,郑 艳,刘 薇,冯 媛,李 英,吴振彪

(空军军医大学第一附属医院临床免疫科,西安 710032;*通讯作者,E-mail:wuzhenbiao@fmmu.edu.cn)

股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是股骨头血供受损或中断,导致骨髓成分及骨细胞死亡,随后发生修复,继而导致股骨头结构改变甚至塌陷的系列病理改变与临床表现。其危险因素包括激素、酒精、创伤、凝血障碍、自身免疫性疾病等[1],其中激素诱发股骨头坏死(GC-ONFH)最为常见。很多研究证实GC-ONFH患者对激素的敏感性存在异质性,与基因多态性相关[2-5]。这些基因可以影响凝血及纤溶系统,如PAI-1、MTHFR基因,很多研究发现PAI-1(4G/5G)、MTHFT C677T基因位点与GC-ONFH相关。有报道发现一些影响药物代谢酶的基因也与GC-ONFH有关,如CYP3A4、CYP3A5、CYP2D6,以及药物转运蛋白基因(ABCB1、ABGC2,等)[6,7],上述基因可能使GC在体内的代谢发生障碍,导致其毒副作用诱发骨坏死。目前以PAI-1(4G/5G)、ABCB1 C3435T作为GC-ONFH相关基因检测应用较为广泛,其中PAI-1基因4G4G型、ABCB1 C3435T基因CC型为ONFH的高危型[8,9],在临床检验用于GC-ONFH高危人群的筛查。

GC-ONFH中约31.2%-43.6%为系统性红斑狼疮(SLE)患者[10]。系统性红斑狼疮是一种全身性自身免疫性疾病,可导致多系统组织损伤,激素在SLE的治疗中发挥重要作用。SLE继发骨坏死,发生率为5%-40%,以股骨头坏死最为常见[11]。目前认为SLE继发ONFH(SLE-ONFH)不仅与应用激素有关,还与SLE原发病相关。有学者指出SLE继发炎症反应、凝血异常、低补体以及SLE异常自身抗体如抗磷脂抗体、抗ds-DNA抗体均可能与ONFH相关[12],这些研究结论不尽一致,对临床的指导价值有限。因此,PAI-1(4G/5G)、ABCB1 C3435T基因能否作为SLE-ONFH的筛查指标有着重要的临床价值,且目前国内未见文献报道。本研究对SLE-ONFH的患者进行PAI-1(4G/5G)、ABCB1 C3435T基因相关性分析,为其可能作为SLE-ONFH早期诊断的指标提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 纳入标准及分组

选择2016-06～2017-06符合2012年系统性红斑狼疮国际临床合作组(SLICC)分类标准的SLE病人,18-65岁,激素用量上应至少满足以下之一:起始量强的松≥30 mg/d,或累积量>10 g,或冲击治疗(甲泼尼龙500 mg或1 000 mg×3 d)。由影像科专业医师对患者的影像图片进行阅片,X线、CT、MRI至少一项符合ONFH影像学表现的SLE患者为SLE-ONFH组,同期进行基因检测的SLE患者为对照组。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器 离心机;荧光检测仪-TL998A型(北京天龙科技有限公司);PHARM-GENE 01 SNP分析保存液(商品名:耀金保),用于进行SNP分析前对血液、组织标本的保存。PHARV-GENE 200 SNP分析样本处理试剂(商品名:耀金分),用于荧光染色原位杂交及染色体核型分析、化学药物用药指导时的样本分析。氯化铵溶液(北京华夏时代基因科技发展有限公司)。

1.2.2 检测方法 在1.5 ml离心管中加入1 ml×NH4Cl预处理液(NH4Cl溶液与灭菌用水体积比1 ∶9),取200 μl混匀的临床全血,加入对应编号的NH4Cl预处理液离心管中,上下颠倒10次,室温静置5 min,混匀后液体色会逐渐变为澄清的红色;放入离心机,室温3 000 r/min,5 min,将上层透明红色液体吸取干净,注意避免吸走沉淀在管底的白细胞;向富集有白细胞的离心管中加入50 μl PHARM-GENE 01 SNP分析保存液,反复吹打混匀。室温静置20-30 min,期间颠倒混匀2次,待检测。根据需要检测的基因位点,取出相应PHARV-GENE 200 SNP,并将样本编号标注在试剂管上;向相应编号的PHARV-GENE 200 SNP试管中加入1.5 μl处理后的白细胞样本;盖紧管盖,置入荧光检测仪;采用荧光染色原位杂交及染色体核型分析系统自动判读荧光信号值,获取荧光曲线图,进行PAI-1(4G/5G)、ABCB1 C3435T基因分析。结果判读:PAI-1(4G/5G)基因4G4G型为高危型,4G/5G、5G5G型为低危型;ABCB1C3435T基因CC型为高危型,CT、TT型为低危型。

1.3 统计方法

用SPSS 13.0软件对临床资料进行分析,计量资料用t检验比较,两组基因型差异比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 SLE-ONFH组与对照组骨坏死及激素应用情况

SLE-ONFH组共19例患者(女/男=18/1),平均年龄33.4岁,平均激素起始量为36.9 mg/d,17例激素累积量大于10 g,4例行激素冲击治疗,13例累及双侧股骨头,9例合并狼疮肾炎;对照组共21例(女/男=19/2),平均年龄31.9岁,平均激素起始量为35.7 mg/d,18例激素累积量大于10 g,2例行激素冲击治疗,5例合并狼疮肾炎。两组之间各指标比较均差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

表1 SLE-ONFH组与对照组的SLE患者激素用量及一般情况Table 1 Hormone dosage and clinical data of SLE patients

2.2 两组间PAI-1(4G/5G)的基因型比较

SLE-ONFH组6例SLE患者PAI-1(4G/5G)基因为4G4G型,阳性率为31.6%;对照组3例SLE患者PAI-1(4G/5G)基因为4G4G型,阳性率为14.3%。SLE-ONFH组与对照组PAI-1基因4G4G型差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 两组间ABCB1 C3435T基因型比较

SLE-ONFH组10例SLE患者ABCB1 C3435T基因为CC型,阳性率为52.6%;对照组4例SLE患者ABCB1 C3435T基因为CC型,阳性率为19.0%;SLE-ONFH组ABCB1 C3435T基因CC型明显多于对照组,差异有统计学意义(χ2=4.94,P<0.05,见表2)。

表2 SLE-ONFH与对照PAI-1 4G/5G基因型与ABCB1 C3435T基因型分析Table 2 Genotype analysis of PAI-1 4G/5G and ABCB1 C3435T in SLE-ONFH and SLE controls

3 讨论

PAI-1(4G/5G)和ABCB1 C3435T基因是GC-ONFH的相关基因,但是否与SLE-ONFH相关尚无定论,本研究对SLE-ONFH患者进行PAI-1(4G/5G)和ABCB1 C3435T基因检测,初步证实ABCB1 C3435T基因与SLE-ONFH存在相关性。

纤溶酶激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1))基因启动子区4G/5G多态性与血浆PAI-1活性有密切相关性,PAI-1 4G4G型会导致血浆PAI-1升高,从而影响凝血及纤溶系统,可导致凝血障碍、血管闭塞。很多文献报道激活的血管内凝血可使骨内血栓形成和骨坏死,是非创伤骨性坏死的潜在危险因子之一[13-15]。本研究结果提示SLE-ONFH组PAI-1基因4G4G型的阳性率与对照组相比,差异无统计学意义。我们认为可能与以下因素相关:①SLE疾病本身可能与PAI-1基因相关,使对照组PAI-1 4G4G基因型频率有所升高。有研究发现SLE心血管受损的患者外周血PAI-1水平明显升高[16],间接提示SLE本身也可能出现PAI-1基因4G4G型的高表达;②PAI-1基因与其他疾病具有相关性,如冠状动脉疾病及其他血栓类疾病,也有报道证实PAI-1(4G/5G)基因可能是IgA肾病病情加重的危险因素[17-19];③其他影响因素:SLE-ONFH可能与SLE继发炎症反应、凝血异常、低补体以及抗磷脂抗体、抗ds-DNA抗体相关[12],本研究未能将其纳入到观察指标;④由于样本量偏少,仅观察到两组间PAI-1(4G/5G)基因具有统计学差异的趋势。

ABCB1基因编码的ABCB1参与调控P糖蛋白(P-gp),后者可以转运许多合成类激素,影响激素在体内的吸收和分布[19]。研究报道ABCB1 C3435T基因多态性与GC-ONFH的发生相关,ABCB1 C3435T基因CC型(野生型者)比TT型(突变者)的风险高2-3倍[9,20]。本研究首次将ABCB1 C3435T基因检测应用于SLE-ONFH人群,并从实验设计上除外了激素用量不等带来的偏移,结果提示SLE-ONFH组人群ABCB1 C3435T基因CC型的阳性率显著高于对照组,证明ABCB1 C3435T基因与SLE-ONFH存在相关性(P<0.05),为ABCB1 C3435T基因检测用于SLE-ONFH高危人群早期的筛查提供了理论依据。此外,我们发现SLE-ONFH组中出现狼疮肾炎的发生率明显多于对照组(47.4%vs23.8%),然而狼疮肾炎与SLE-ONFH是否具有相关性,目前暂无相关文献报道,需进一步研究。

综述所述,本研究旨在发现PAI-1(4G/5G)基因和ABCB1 C3435T基因与SLE-ONFH的相关性,结果表明ABCB1 C3435T基因与SLE-ONFH相关,可能成为SLE-ONFH高危人群早期筛查的指标之一。PAI-1(4G/5G)基因与SLE-ONFH虽无相关性,我们认为扩大样本量、纳入更多的临床指标,有助于进一步了解PAI-1基因与SLE-ONFH的关系。