纳米TiO2对土壤中硝态氮质量比及硝酸还原酶活性的影响

封保根, 郭 平, 李琳慧, 孙 影, 陈薇薇

(吉林大学 新能源与环境学院, 地下水资源与环境教育部重点实验室, 长春 130012)

纳米TiO2具有较高的化学稳定性、 热稳定性、 光学性质以及杀菌和自清洁功能, 在材料、 生物和电子等领域应用广泛[1]. 在生产和使用过程中， 纳米TiO2可通过各种途径进入土壤生态系统中, 从而对土壤生态系统环境和功能产生影响.

目前, 关于纳米TiO2对土壤中反硝化作用的影响尚未明确. 反硝化作用作为土壤氮素循环中的一个重要过程, 也是导致土壤中氮流失的主要途径之一, 其在硝态氮质量比和硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)活性方面[11-12]具有重要作用. NR是反硝化作用第一个环节所用酶, 在一定条件下限制反硝化作用速率, 硝态氮作为NR反应的底物, 直接影响反硝化作用的强度[13-14]. 本文采用盆栽实验方法考察纳米TiO2添加量、 土壤类型和植物对土壤硝态氮质量比和NR活性的影响, 为纳米TiO2对土壤生态系统环境和功能风险评估提供科学的理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

表1 供试土壤的基本理化性质Table 1 Basic physicochemical properties of tested soils

供试植物选择紫花苜蓿中苜一号(购于北京市畜牧研究所). 纳米TiO2(d=25 nm)购于广州门德纳米科技有限公司. 聚乙烯花盆规格为高10 cm、 上口直径11 cm、 下口直径7.5 cm.

1.2 实验设计

采用盆栽实验方法, 共设计14个处理, 每个处理重复3次, 实验设计列于表2. 在每个花盆中先加入0.3 kg风干土壤样品, 再加入纳米TiO2并混匀. 常规施肥量为w(N)=0.2 g/kg,w(P)=0.06 g/kg,w(K)=0.11 g/kg. 氮肥、 磷肥、 钾肥分别为尿素、 磷酸二氢钾、 硫酸钾. 实验期间保持土壤含水量为田间持水量的60%. 无论是否种植紫花苜蓿, 均在第0,15,30,45,60 d取样测量土壤中硝态氮质量比和NR活性. 土壤硝态氮素质量比测定方法同1.1； 采用酚二磺酸比色法测定土壤NR活性[16].

1.3 数据处理与分析

由于TiO2对硝态氮质量比和NR活性具有降低作用, 因此采用降低程度表示TiO2对硝态氮质量比和NR活性的影响：

绘图工具使用Origin 8.0软件(美国OriginLab公司), 统计分析采用SPSS 21软件(美国IBM公司)进行.

表2 实验设计Table 2 Experimental design

2 结果与分析

2.1 纳米TiO2添加量对黑土中硝态氮质量比和NR活性的影响

图1 纳米TiO2添加量对黑土中硝态氮质量比(A)和NR活性(B)降低程度的影响Fig.1 Effects of nano-TiO2 addition on degree of reduction of mass ratio of nitrate nitrogen (A) and NR activity (B) in black soil

在土壤微生物和酶的作用下, 尿素水解为铵态氮, 铵态氮氧化为硝态氮, 土壤中硝态氮主要来源于土壤的硝化作用[17]. 纳米TiO2对黑土中硝态氮质量比的影响可能与纳米材料对土壤微生物和酶的生态毒性有关[3-4]. 因此, 纳米材料通过抑制土壤脲酶的活性, 抑制土壤中铵态氮的转化, 减少硝化作用的反应底物, 从而降低土壤中硝态氮的质量比. 此外, 纳米材料对土壤中硝化细菌活性具有一定的抑制作用[7,9,18]. 纳米TiO2通过抑制土壤的铵态氮转化速率和硝化作用, 抑制土壤中硝态氮的产生, 从而降低土壤中硝态氮的质量比. 随着培养时间的增加, 土壤性质对纳米TiO2生物活性的抑制作用加强， 对土壤微生物的胁迫作用减弱, 因此实验中土壤硝态氮质量比降低程度呈先增加后降低的趋势. 随着纳米TiO2添加量的增加, 纳米TiO2对硝态氮质量比的降低程度增加.

硝态氮作为土壤反硝化作用的底物, 其质量比还受NR活性的影响. NR是反硝化作用中的第一个酶, 可能受底物硝态氮质量比降低的影响而降低了NR的酶活性, 也可能受纳米TiO2的影响而降低其酶活性. 纳米TiO2可以吸附相关酶, 导致一系列酶学性质(如最适pH值、 稳定性、 活性及动力学)发生显著变化[19]. 大量纳米TiO2进入土壤能为NR提供大面积的反应位点[20], 从而增强纳米TiO2对NR的毒害作用, 降低NR活性. 此外, 大量纳米材料进入土壤后会对土壤的理化性质(如pH值和离子强度)产生影响[19], 进而影响NR活性. 由于纳米TiO2可穿过细胞膜进入细胞内, 破坏细胞膜并扰乱细胞内的生理活性, 因此降低了NR酶活性[21-22]. 随着培养时间的增加, 土壤性质对纳米TiO2生物活性的抑制作用加强， 对土壤微生物的胁迫作用减弱, 使纳米TiO2对NR活性的降低程度呈先增加后降低的趋势； 随着投加量的增加, 纳米TiO2对NR的胁迫作用增大, 其对NR活性的降低程度也增加. 土壤中NR受纳米TiO2的影响和诱导底物硝态氮质量比的减少而使其活性降低. 在培养初期, 随培养时间的增加, NR活性抑制效果增加, 在第15天降低程度达到最高. NR活性增强, 促进了硝态氮的还原, 从而降低了硝态氮的质量比. 硝态氮质量比受纳米TiO2对铵态氮转化以及硝化作用的抑制和NR活性增加的影响, 在第30天降低程度达到最高. 随着培养时间的增加, 纳米TiO2的降低作用减弱, 其对土壤中硝态氮质量比和NR活性的降低程度逐渐降低. 因此, 纳米TiO2对NR活性的降低作用大于对硝态氮质量比的降低作用, 进一步说明纳米TiO2对土壤反硝化作用具有抑制作用.

2.2 TiO2对不同土壤中硝态氮质量比和NR活性的影响

图2 1.0 g/kg的纳米TiO2对不同土壤中硝态氮质量比(A)和NR活性(B)降低程度的影响Fig.2 Effects of nano-TiO2 (1.0 g/kg) on degree of reduction of mass ratio of nitrate nitrogen (A) and NR activity (B) in different soils

纳米TiO2(1.0 g/kg)对3种土壤中硝态氮质量比和NR活性有不同的抑制效果, 可能是由于土壤理化性质对纳米TiO2的生物活性具有一定影响所致. 实验所用的3种土壤在pH值、 有机质和CEC等指标上有显著不同. 土壤中的有机质、 表面电荷、 土壤黏性物质、 pH值和离子强度等是影响金属纳米颗粒毒性的主要因素. 纳米粒子在土壤中会发生团聚作用, 降低其活性, 较高的有机物质量比和离子强度可增强纳米TiO2在土壤中的团聚作用[23-24]. 土壤的pH值和有机质可改变纳米TiO2的电动性质与聚集状态, 从而影响纳米TiO2的稳定性和迁移性[25], 土壤有机质质量比与纳米材料吸附量成正比[26]. 在实验中, 沙土中硝态氮质量比和NR活性受纳米TiO2影响的降低程度最大, 可能是由于供试土壤中沙土的pH值和有机质质量比较低, 进入沙土中的纳米TiO2易发生团聚, 使得迁移性和稳定性均比进入黑土和草炭土中的TiO2弱, 导致纳米TiO2的生物毒性作用比黑土和草炭土中的强. 由于黑土与草炭土的pH值相近, 草炭土中有机质质量比较黑土中的高, 因此纳米TiO2在草炭土中对硝态氮质量比和NR活性的降低效果略低于黑土.

土壤的pH值会影响硝化作用和反硝化作用, 中性或弱碱性土壤有利于硝化作用和反硝化作用的持续进行[27]. 沙土的pH呈酸性, 抑制土壤的硝化作用和反硝化作用, 进而降低土壤中硝态氮质量比和NR活性. 黑土和草炭土的pH为弱碱性, 对土壤中硝态氮质量比和NR活性的降低作用较弱. 土壤酶与有机质在纳米材料上均有较强的吸附能力, 产生位点竞争[28]. 因此, 有机质质量比增加可降低纳米TiO2的生物活性, 但有机质能促进纳米材料对土壤中酶的吸附作用, 即促进纳米材料在土壤中的扩散, 从而使其表面的吸附位点增加[29].

2.3 紫花苜蓿存在下纳米TiO2对土壤中硝态氮质量比和NR活性的影响

图3 紫花苜蓿存在下纳米TiO2对土壤中硝态氮质量比(A)和NR活性(B)降低程度的影响Fig.3 Effects of nano-TiO2 on degree of reduction of mass ratio of nitrate nitrogen (A) and NR activity (B) in soil in presence of alfalfa

种植紫花苜蓿能降低纳米TiO2对土壤中硝态氮质量比和NR活性的降低程度, 可能与紫花苜蓿的生物效应有关. 纳米材料可通过水分子通道或离子通道、 内吞作用、 穿透作用及结合环境介质中的有机物质等进入植物根系细胞[30], 从而降低了土壤中纳米TiO2的质量比及其生物活性. 植物在生长过程中会向土壤分泌根系分泌物, 如碳水化合物、 有机酸和酶等. 植物根系分泌物会对纳米材料的生物活性产生一定影响, 降低其毒性效应[31]. 因此, 种植紫花苜蓿可降低纳米TiO2在土壤中的生物毒性.

综上所述, 本文可得如下结论: 纳米TiO2对土壤中硝态氮质量比和NR活性均具有降低作用, 该作用受纳米TiO2添加量、 土壤类型和植物的影响, 降低程度随时间呈先增加后降低的趋势； 在相同采样时间下, 纳米TiO2添加量越高, 其对土壤中的硝态氮质量比和NR活性降低程度越明显； 纳米TiO2对不同土壤中硝态氮质量比和NR活性降低程度不同, 降低程度顺序为沙土>黑土>草炭土； 紫花苜蓿存在下, 纳米TiO2对土壤中硝态氮质量比和NR活性的降低程度减弱, 即种植紫花苜蓿可降低纳米TiO2在土壤中的生物毒性； 纳米TiO2对NR活性的降低程度大于对硝态氮质量比的降低程度.