一株耐酸SRB的分离及其脱硫除镉性能

王继勇,肖 挺,何 伟

一株耐酸SRB的分离及其脱硫除镉性能

王继勇*,肖 挺,何 伟

(武汉理工大学化学化工与生命科学学院,湖北 武汉 430070)

为减轻酸性矿山废水引起的环境污染,为矿山废水处理提供潜在的菌种资源,从土壤中分离出一株耐酸的硫酸盐还原菌SRB1并探讨了该菌株的还原硫酸盐和除镉特性.结果表明该菌株具有较强的脱硫除镉能力,其最低耐受pH值,最适温度,最大耐Cd2+浓度分别为3.7,35℃和40mg/L.在COD/SO42-³2,Cd2+浓度£30mg/L条件下,除镉率可达99%以上.在高浓度Cd2+和SO42-的体系中,该菌对Cd2+有较强的吸附作用,能将Cd2+从50mg/L降至15.5mg/L,吸附率达58 %,采用二次培养能将SO42-从1.5g/L降至0.04g/L,脱硫率达97.3%,Cd2+浓度几乎降为零.TEM、FTIR、SEM表征显示,在镉胁迫下,该菌株的细胞形态发生改变,吸附前后,红外吸收峰改变明显,沉淀颗粒含有结晶CdS.

硫酸盐还原菌；酸性矿山废水；脱硫除镉

因矿山的开采排放出大量危害性大、污染面积广的酸性矿山废水(AMD),AMD中SO42-浓度较高,呈较强酸性,pH值在3.0~4.0,且还含有大量的铜、镉、铬、铁等重金属离子[1-2],而镉作为一种毒性较强的重金属,已被国际癌症研究机构列为第一类致癌物质.AMD不能直接循环利用,若排入水体环境,会使水体pH值改变,破坏水体生态系统,进而降低水体自净能力[3-4];重金属离子会毒化土壤,影响植被生长,对环境造成巨大的危害,因此成为世界各国环境工作者面临亟需解决的重大问题.

目前研究AMD的治理技术有吸附法、中和法、人工湿地法、微生物法等,生物法因其具有成本低、效果好等优点,且以硫酸盐还原菌(SRB) 为代表的生物法作为一项新的实用技术而备受青睐[5-6].在厌氧条件下,利用SRB将硫酸盐还原为H2S,溶解态的S2-与废水中的重金属离子反应生成溶解度低的金属硫化物沉淀[7-8].

然而,SRB处理AMD存在缺乏廉价有机碳氮源、菌株耐酸性较差、需较高厌氧条件等问题,使得实际应用困难.为解决碳氮源问题,顾风云[4]以廉价的大豆粕发酵液为培养基氮源培养SRB菌液处理模拟AMD,SO42-、Fe2+、Cu2+等指标均能达到排放标准;肖利萍等[9]运用生活污水、鸡粪和锯末混合物发酵液作为新型有机碳源驯化SRB使SO42-去除率可达90%以上;李宁[5]先用城市生活污水稀释AMD避免了SRB耐酸性差的缺点,再用SRB处理,硫酸根去除率可达82.6%,各金属离子均有较高去除率.

目前耐酸性SRB菌株少有报到,且SRB在酸性环境难生存、处理效率低、效果差,为此本研究从土壤样品中通过耐酸性驯化分离出一株耐酸性SRB,以脱硫除镉率作为考察指标,对其进行单因素实验、吸附、沉淀实验,均得到较好的实验结果,为其实际应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 土壤来源

土壤样品来自武汉理工大学某花坛.

1.2 培养基及检测方法

1.2.1 培养基 液体培养基: K2HPO40.5g, NH4Cl 1.0g, Na2SO42.22g, CaCl20.05g, MgCl2·6H2O 0.05g,乳酸钠4.56g,CdCl2(1g/L) 1.5mL,将上述试剂配制成1L溶液,121℃高压灭菌20min,冷却后再加入经过除菌的硫酸亚铁0.1g,抗坏血酸0.2g.

固体培养基: 在液体培养基中加入2% (质量/体积)琼脂且不加CdCl2.

实验中用到的试剂均为分析纯.

仪器:A360型紫外-可见分光光度计(上海翱艺仪器有限公司);pH10S-E笔式酸度计(上海精密仪器仪表有限公司);ORP-422型氧化还原电位测定仪(上海康仪仪器);JSM-IT300型场发射扫描电子显微镜(SEM)系统(日本电子株式会社);JEM-2100型高分辨透射电子显微镜(美国Gatan);D8Adwance 型多功能X射线衍射仪(德国布鲁克AXS公司); Nicolet6-700型傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo电子科学仪器公司)等.

1.2.2 检测方法 pH值、氧化还原电位(ORP)分别采用pH值计、ORP仪测量,SO42-浓度采用铬酸钡分光光度法测定[10],化学需氧量(COD)采用重铬酸钾氧化法[10],Cd2+浓度采用沈昱等[11]提出的方法测定.最后结果均为3个平行的平均值.

1.3 实验方法

1.3.1 耐酸菌株的富集、驯化及分离 称取5g土壤样品至装有100mL无菌水和玻璃珠的锥形瓶中,充分振荡后静置2h,取其上清液5mL接种于装有150mL液体培养基(pH值调至6.0~6.5)的厌氧瓶中,于35℃,95r/min恒温培养箱中培养,直到培养基完全变黑,并用湿润的醋酸铅试纸检测有H2S生成,说明培养基中已富集大量的SRB.依次转接入更低pH值梯度的液体培养基中,进行菌株的耐酸性驯化至耐pH值为3.5~4.0.然后采用稀释涂布-叠皿夹层培养法[12]进行厌氧分离培养,待长出黑色单菌落,挑取单菌落转入液体培养.交替进行稀释涂布、夹层培养、挑取单菌落液体培养等操作纯化多次,便可获得一株纯SRB菌株[13].

1.3.2 耐酸菌株的生长特性研究 (1)生长曲线的测定及生长过程pH值、ORP、SO42-、Cd2+的变化曲线:以不接菌的液体培养基为对照,每隔6h测定接种液的OD600、pH值、ORP、SO42-、Cd2+.以培养时间为横坐标,绘制生长曲线及变化曲线.

(2)不同培养条件对菌株脱硫除镉率的影响:将菌株接种于含Cd2+10mg/L,pH值为3.7的液体培养基的厌氧瓶中;分别置于20,25,30,35,40℃,95r/min恒温培养箱中培养以考察温度影响;保持Na2SO4质量不变,改变乳酸钠的质量,调节溶液碳硫比(COD/ SO42-)分别为0.5,1,2,3,4,于35℃,95r/min恒温培养箱中培养以考察碳硫比影响;用CdCl2(1g/L)分别调节Cd2+浓度为10,20,30,40,50mg/L,于35℃,95r/min恒温培养箱中培养以考察Cd2+浓度影响.接种量均为2%,液体培养基均为150mL,分别在0h和60h取样,以未接种的液体培养基作空白对照,测定SO42-及Cd2+的浓度,再计算出脱硫除镉率.

1.3.3 耐酸菌株的除镉作用研究 (1)SRB对Cd2+的吸附作用: 将培养至对数生长期的150mL菌悬液10000r/min离心15min,去上清液,用无菌水洗涤2~3次,离心,去上清液,菌体沉淀溶于30mL无菌水中,得到高浓度菌悬液.取20mL置于预处理后的3500Da透析袋中,置于初始Cd2+50mg/L、pH值为4.0的250mL溶液中,35℃恒温磁力搅拌,用20ml无菌水加入透析袋做空白对照,不定时测定Cd2+的浓度.

(2)SRB对Cd2+的沉淀作用:以2%接种量将菌株接种于装有含Cd2+25mg/L、SO42-1500mg/L的150mL液体培养基(pH值为4.0)的厌氧瓶中,调节溶液碳硫比为2,于35℃,95r/min恒温培养箱中培养,以未接种的液体培养基作空白对照,不定时测定SO42-、Cd2+的浓度.

数据采用Excel 2003或Origin 9处理并绘图,各值以3个平行实验的平均值形式给出,且标有误差线.

2 结果与讨论

2.1 耐酸性SRB菌株的分离

通过多次驯化培养和分离纯化,分离出一株耐酸性的硫酸盐还原菌,命名为SRB1,其最低耐受pH值为3.7.在固体培养基中,35℃恒温培养48h后长出菌落,为圆形小菌落,直径2~3mm,固体培养基中含Fe2+时为黑色,无Fe2+存在时为湿润透明状.在TEM下该菌体形态为短棒状,细胞大小约为0.5μm´1μm.

2.2 菌株的生长曲线

在菌株SRB1培养过程中,前12h菌株生长缓慢,此时菌株要适应酸性及含Cd2+环境,12~50h为对数生长期,50~66h为稳定期,OD600维持在0.44左右,66h后开始步入衰亡期.随着菌株的生长,溶解在培养基内的H2S含量增高,当沉淀完Cd2+后,剩余的H2S会严重抑制菌株的生长,这与罗容珺等[14]的研究结果类似.

2.3 菌株生长过程pH值、ORP、SO42-、Cd2+的变化曲线

图1 SRB1生长过程中pH值和ORP变化

图1所示,培养过程中pH值随着菌株生长能达到最大值4.5而后降低.在SRB的异化硫酸盐还原作用下,硫酸盐被还原为S2-,而S2-又会结合H+生成H2S[15],从而使培养基中pH值升高.在厌氧环境下,多余的H2S又会溶解于培养基中使pH值降低.ORP随着菌株的生长持续降低,60h后稳定在-320mV左右,由于S2-,HS-与H+结合生成反应的终产物H2S,使体系的氧化还原电位下降[8],不少学者研究表明[4-6],硫酸盐还原菌厌氧培养时所用培养基的ORP要求在-100mV以下.

SRB生长过程要消耗SO42-,生成的S2-能结合Cd2+形成硫化镉沉淀,从而达到脱硫除镉的目的.由图2知,在10mg/L的Cd2+浓度下,SRB1能很好的生长,SO42-从1.5g/L降至0.55g/L,脱硫率超过60%,而Cd2+基本将为0,除镉率约100%.在SRB还原硫酸盐过程中,随着培养基中碳源的消耗,且该过程产生的H2S、HS-、S2-对细菌有毒害作用,因而未将SO42-降解完全.

图2 SRB1生长过程SO42-、Cd2+浓度变化曲线

在SRB1的对数生长期,有机物含量丰富,生存环境适宜,pH值、ORP也比较适宜其生长,所以SO42-和Cd2+去除效率也快,此时SRB1的活性最高,因而后续实验采用该时期的菌悬液转接.培养60h后,SO42-和Cd2+浓度基本稳定,因而此时检测其浓度最为合适.

2.4 温度对菌株脱硫除镉率的影响

温度是影响硫酸盐还原的重要环境因素,它直接决定SRB的生长速度和代谢活性[16].如表1示,温度在30~40℃时,SRB1有较高的脱硫除镉率,35℃时达到最高,分别为55.3%和100%,是其生长的最适温度.温度低于30℃时,脱硫率低于10%,除镉率低于15%,因而SRB1属于中温菌.目前研究报道的SRB大多为中温菌,一般适合在28~38℃左右生长,临界湿度是45℃[2].低温会影响细胞中蛋白质的调控方式和功能,而高温可使酶失活,都会影响SRB的正常生理代谢.

2.5 碳硫比对菌株脱硫除镉率的影响

COD/SO42-影响SRB分解代谢过程,只有足够的碳源才能产生足够的ATP来进行还原.表1所示,COD/SO42-³2时,处理效果好,脱硫率达55 %以上,除镉率相应较高,而COD/SO42-<2时,脱硫除镉率均有下降,分析原因有:一是一些学者[4,9]认为,由于还原SO42-过程在细胞内,COD和SO42-要渗透到细胞体内才能进行SO42-还原,而它们的渗透能力不同,当COD/SO42-值体外高于体内并增大时,SO42-的去除率也相应增大,从而使Cd2+除去也增大;二是碳源较低时,必然会使菌株还原力不足,影响其脱硫除镉效率.而从经济上考虑,COD/SO42-为2时较为合适.

2.6 初始Cd2+浓度对菌株脱硫除镉率的影响

SRB虽然能去除Cd2+,但较高Cd2+浓度对其生长和代谢活性有抑制作用.表1所示,当Cd2+£30mg/ L时,SRB1有较高的脱硫除镉率,脱硫率达最高达55.4%,当Cd2+>30mg/L时,脱硫除镉效果明显变差,太高的Cd2+浓度有毒害作用,影响菌株的生长,SRB1的最大耐镉浓度为40mg/L,当Cd2+达到50mg/L时,SRB1基本不能生长,脱硫除镉率均小于3%,因此高浓度镉废水需重新研究方法或提高SRB1对镉的耐受性.

研究学者也对其他重金属做过研究,Oliver等[17]发现金属对SRB抑制顺序为Cu>Cd>Ni>Zn>Cr>Pb,抑制浓度分别为20,20,20,25,60,75mg/L.赵阳国[18]发现Fe3+使硫酸盐去除率降至20%.AMD中不乏有其他重金属离子,所以在实际废水处理中要比实验室处理困难很多,研究其他重金属离子对SRB1的耐受性也至关重要.

表1 不同培养条件对SRB1脱硫除镉率的影响

2.7 SRB1对Cd2+的吸附作用

当Cd2+浓度大于30mg/L时,SRB1的脱硫除镉率降低,因为重金属镉会抑制细菌的生长,从而抑制其新陈代谢,阻碍SO42-的还原.为了解决SRB1在高浓度Cd2+中不能发挥其除镉能力的问题,在此研究SRB1对高浓度Cd2+的吸附作用,在吸附过程中, SRB1虽不能进行新陈代谢,但其能通过多种途径将Cd2+吸附在其细胞表面,结果如图3示,Cd2+从50mg/L降低并稳定在15.5mg/L,扣除空白对照,SRB1共吸附Cd2+浓度为29mg/L,吸附率达58%,实现对Cd2+较好的吸附去除,这也说明了活细胞内积累重金属离子的能力是有限度的. 罗丽卉等[19]利用SRB2产生的EPS吸附Cu2+,24h去除率为38%.

吸附Cd2+降低到15.5mg/L后,在SRB1的耐镉范围,可通过新陈代谢去除,为高浓度Cd2+的去除提高实验依据,即先通过细胞吸附使Cd2+降低到SRB1的耐镉范围,再进行细菌培养进一步除镉.

许多学者研究表明,SRB细胞表面有氨基、羧基、羟基和磷酰基等电负性基团[20],这些基团能与金属离子发生配位络合,从而除去重金属离子.图4是吸附Cd2+前后SRB1的红外光谱变化情况,在3411cm-1的强宽峰是典型的缔合羟基,它能以某种程度的氢键结合于酰胺中的N—H,此强宽峰也可能反映了酰胺中N—H的伸缩振动;1692cm-1处的吸收峰为羰基吸收峰;1402cm-1是羧酸阴离子(羧酸酯)的对称振动峰;1152cm-1是糖类C—O—C的伸缩振动峰,上述结果反映了SRB1细胞上镶嵌着众多蛋白质和多糖的官能团,如羟基、酰胺和羰基等.

图3 SRB1吸附Cd2+过程浓度变化

SRB1吸附Cd2+后,红外谱图的变化主要有以下4个方面: (1)表征羟基的振动峰发生位移(从3411cm-1变化到3378cm-1)直至消失,可推断出羟基基团在Cd2+吸附中发挥了非常重要的作用; (2)1692cm-1处的羰基吸收峰强度逐渐减弱,说明C=O 官能团与Cd2+可能发生了配位作用;(3) 1402cm-1羧酸阴离子的对称振动峰强度也发生较大变化;(4)1152cm-1处表征糖的C—O的振动峰位置由1152cm-1移至1163cm-1,说明糖中的伯醇基团参与Cd2+的络合.因而吸附过程中起主要作用的是—OH、C—O—C和C=O等基团,当吸附平衡后,菌体发生聚沉,导致吸收峰减弱直至消失.许多文献报道,这些活性基团在金属生物吸附中发挥重要作用,如—OH和C—O—C是烟曲霉吸附Pb2+的主要吸附位[21];C=O则是红酵母对Ag+吸附的主要位点[22].

图4 SRB1吸附Cd2+前后红外光谱图

2.8 SRB1对Cd2+的沉淀作用

图5 SRB1沉淀Cd2+过程浓度变化

在含25mg/L Cd2+的培养基中,SRB1能完成新陈代谢过程,SO42-从1.5g/L降至0.56g/L,脱硫率达63%,而Cd2+基本降为0,达到理想去除状态.为进一步去除SO42-,将其中一瓶培养60h后的菌液进行二次培养,即将厌氧瓶敞口,然后进行高温灭菌,无菌环境中冷却后加2g乳酸钠、0.1g抗坏血酸,再以2%接种量接种,培养条件不变.通过二次培养,SO42-从0.56g/L降至0.04g/L,总脱硫率达97.3%,实现了SO42-的深度去除.

SRB1在此过程中的形态和形成的沉淀表征如图6所示,在TEM下,SRB1已经完全变形,被Cd2+胁迫成无规则状,沉淀由细菌细胞与椭球形小颗粒均匀包裹而成.在细菌表面包裹有大小不一的椭球形颗粒,且团聚现象明显.这种现象的原因可能是: SRB1细胞表面的羟基、酰胺和羰基等官能团先吸附Cd2+,且在细胞壁上的Cd2+离子作为有效结晶位点与SRB1新陈代谢产生的S2-、OH-反应形成CdS、Cd(OH)2沉淀;由于不同结合位点的Cd2+含量不同,使椭球形颗粒粒径和相互间团聚程度也不同,最终形成了图中所示形状.

图6 镉胁迫下菌体形态及沉淀形状

为确定沉淀组成,对其进行X射线衍射分析(XRD),所得图谱见图7,特征峰2θ为26.3°、44.0°和52.2°,查询XRD标准谱图进行对比后分别对应的晶面为(111)、(220)和(311),而沉淀的2θ吸收峰与标准谱图中的吸收峰值基本吻合且在特定位置衍射峰尖锐,说明沉淀中含有结晶度较好的CdS,但是有些峰已经被弱化或发生的漂移,说明其他杂质也较多,如Cd(OH)2等.

由于AMD成分复杂,pH值较低,重金属种类多且浓度高,目前处理AMD的过程中,都是先加入石灰中和酸以调节pH值,使环境能适合SRB的生长,这样会带来二次污染[1,2];有学者也通过改进处理工艺、反应器来提高处理效果,这都导致处理成本增加.本文驯化分离出的耐酸性SBR1,其耐镉能力也比较强,在实验室小试阶段,采用间歇厌氧挂膜反应器对模拟废水进行处理,初始硫酸根浓度为1.5g/L,Cd2+浓度为25mg/L,35℃恒温,转速为95r/min,培养60h后能达到与实验初期类似的效果,脱硫率达50%,除镉率达99%.

图7 沉淀XRD图谱

在实验结果的基础上,对于比较理想的条件,可以采用直接添加菌剂的方法处理AMD;对于高浓度的重金属环境,可以采用先吸附再沉淀的方法,即将已在对数生在期的SRB1(可以是在处理过程中剩余的菌液)进行固定化处理,投入到AMD中进行前期吸附使重金属离子浓度降低到一定值,能避免SRB耐酸性差、需较高厌氧条件等问题,再投加SBR1菌剂进行后续处理;对于高浓度的硫酸根废水,可以采用多次处理的方法逐步脱硫.其中的碳源可以是含淀粉较高的废弃植物或农作物,因为在碳源实验中也证实了SRB1能利用淀粉,可有效解决缺乏廉价有机碳氮源的问题.

3 结论

3.1 将土壤样品经耐酸性驯化分离出一株耐酸性硫酸盐还原菌SRB1,可在pH值为3.7条件下生长,菌落为小圆形,TEM下形态为短棒状.

3.2 SRB1生长过程中,pH值可升至4.5,ORP持续降低至-320mV并保持稳定;在最适条件下,脱硫率达55%以上,除镉率达99%以上.

3.3 在实验条件下,SRB1对Cd2+有较好的吸附性,吸附量可达29mg/L,吸附率达58%,FTIR显示吸附前后,羟基、酰胺和羰基等吸收峰均有明显变化.

3.4 SRB1进行二次培养可将SO42-深度去除,最终降至0.04g/L,脱硫率达97.3%;SRB1代谢过程与Cd2+形成的沉淀成分复杂,含结晶CdS.

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Isolation and characterization of an acid-resistance SRB strain with the efficient of desulfurization and cadmium-removal.

WANG Ji-yong*, XIAO Ting, HE Wei

(Wuhan University of Technology, School of Chemistry and Life Science, Wuhan 430070, China)., 2018,38(11)：4255~4260

In order to reduce the environmental pollution caused by acid mine drainage,and provide potential microbiology resources for mine drainage treatment, an acid tolerant sulfate educing bacteria strain SRB1was isolated from soil,and its characterization of reducing sulfate and cadmium removal were discussed. The results showed that the strain had high desulfurization and cadmium removal potential, and its lowest tolerant pH value, optimum temperature and maximum Cd2+concentration were 3.7, 35°C and 40mg/L, respectively. Under the condition of COD/SO42-³2, Cd2+concentration£30mg/L, the cadmium removal rate can reach more than 99%. In the high concentration of Cd2+and SO42-system, the strain had strong adsorption on Cd2+, Cd2+can be decreased from 50mg/L to 15.5mg/L, the adsorption rate reached 58%. Using secondary culturing SO42-might be reduced from 1.5g/L to 0.04g/L, the desulfurization rate reached 97.3%, and the Cd2+concentration almost decreased to 0. TEM, FTIR, SEM characterization showed that the cell morphology of the strain was changed under cadmium stress, the infrared absorption peak was changed obviously before and after adsorption, and the precipitated particles contained crystalline CdS.

sulfate reducing bacteria；acid mine drainage；desulfurization and cadmium removal

X172,Q939.9

A

1000-6923(2018)11-4255-06

王继勇(1966-),男,湖北松滋人,副教授,硕士,研究方向为土壤重金属污染修复.发表论文11篇.

2018-04-03

国家自然科学基金资助项目(46120511)

* 责任作者, 副教授, wangjiyong66@sina.com