筛选和培育镉低积累水稻品种的进展和问题探讨

陈彩艳，唐文帮

（1.中国科学院亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室，湖南 长沙410125；2.湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128）

随着工业化的发展，我国土壤受镉（Cd）、砷（As）等重金属污染的面积逐步扩大。其中，镉污染耕地超标位点为7.0%[1]。水稻是一种对镉吸收能力较强的植物，低浓度的土壤镉污染会导致稻米品质下降，高浓度的土壤镉污染会导致水稻减产。推广镉低积累品种（variety）、全生育期淹水灌溉（irrigation）、酸性土壤pH值调增（pH）相结合的“VIP”技术体系是重金属镉污染超标农田治理的有效措施[2]。由于镉低积累品种的效应不如水分管理和pH值调控的效应明显，在相当长的时间里人们对低积累品种的研究与推广工作并未引起足够重视。但是，最近几年的污染农田安全利用实践表明，镉低积累品种是镉超标农田安全利用的必要条件。推广低积累水稻品种既不增加水稻生产成本，又与现有的耕作制度无明显冲突，因此其在整个镉污染农田安全利用技术体系中的份量正在逐步加重。

1 镉低积累品种的定义及其特征

1.1 镉低积累水稻品种的定义

简单地讲，镉低积累水稻品种就是在相同土壤环境条件下稻米镉积累量相对较低的水稻品种。镉低积累品种是一个相对的概念，由于稻米镉积累受土壤环境和农艺措施的综合调控，目前人们还没有发现绝对的镉低积累品种。结合镉低积累品种的遗传学和农学特征，这类品种在镉高度污染的土壤中（有效态含量高）种植，稻米镉积累量相对较低；在镉中、轻度污染的土壤中种植，稻米镉积累量可以达标；在镉达标的土壤中种植，稻米镉积累量不超标。当土壤镉污染程度高时，稻米镉不可能达标，这个时候基因型决定的表型差异变异能够最大化，所以镉低积累品种表型最明显；中、轻度污染条件下，镉低积累品种和高镉品种稻米镉积累量也能表现出差异，但差异相对较小，环境变异和栽培措施造成的差异有时会掩盖基因型造成的差异，通过农艺措施调控可以实现稻米达标；达标土壤条件下，重金属低积累品种的镉低积累特性表现稳定，不随环境变化和栽培措施的改变和导致稻米镉积累超标。当然，作物重金属积累涉及到食品安全、生态修复、农学及遗传学等多个领域，人们的知识背景不同，对重金属低积累品种的界定也有不同标准。如在食品安全领域侧重于强调低积累品种的农产品要符合国家安全标准，而在生态修复领域则侧重于强调其吸收能力和富集系数要小于某一特定值。

表 1 糙米镉含量与其他金属元素间的相关性[2]Table 1 Correlations of grain Cd and other metal elements concentrations

1.2 镉与其他重金属的互作效应

镉低积累品种中镉与微量元素的关系是人们的一个重要关注点。作为一种非必需元素，镉是伴随生物体内其他必需元素的吸收和转运而进入生物体内的。如镉的吸收是通过NRAPM5，NRAMP1进行[3-4]，转运由HMA2和LCT1等基因参与完成[5-6]，这些基因既能转运镉，也能转运锌和锰等其他必需元素。另外，在生产上施用一些必需元素制剂，如硅、锌、铁、锰等制剂也可能降低稻米的镉积累量[7]。因此，人们担心重金属低积累品种在降低重金属含量的同时会降低必需微量元素的含量，从而降低稻米的营养价值。我们研究了铜、铁、镁、锰、镍、铅和锌等金属元素与糙米镉含量的相关性，发现除个别情况外，在田间镉污染情况下生产出的稻米的镉含量和这几种元素间均无显著相关性（表1）[2]，该结论与已有的遗传学研究结果一致。从遗传学的角度分析，目前还没有一个已知的稻米镉积累的QTL与这些必需元素含量的QTL区域重叠。因此，已有的证据不支持降低稻米镉含量会导致营养元素含量下降的推断。上述看似相互冲突的研究结果表明，目前已经发现的控制稻米镉吸收、转运的这些基因参与了稻米镉积累的必要过程，但不是控制稻米镉积累基因型差异的关键基因。我们最近的分子遗传学研究也验证了这一点，稻米镉积累的品种间差异主要是OsHMA3的等位变异引起的。该基因定位在液泡膜上，专一性地将进入细胞质的镉向液泡内转运，阻滞镉向地上部转运，从而降低镉在籽粒中累积。该基因的功能缺失突变会造成稻米高富集[8-11]。相对于多数粳稻品种的强等位基因型而言，多数籼稻品种具有一个弱等位基因型，因此籼稻的稻米镉含量一般高于粳稻，而整合了粳稻相关等位基因的籼稻品种则积累较低的镉。

1.3 稻米镉积累与水稻生育期及产量的相关性

水稻的生育期越长，其产量会相对较高，同时其吸收并积累到体内的镉会相对较多。因此人们凭直觉认为，稻米镉积累与生育期及产量成正比。关于生育期和稻米镉积累的相互关系，不同的学者得到不同的结论，这既可能与选用的材料有关，也可能与栽培措施（如水分管理）有关。最早认为镉与生育期相关联的遗传学证据来源于日本科学家的稻米镉积累QTL定位研究，其定位若干与镉含量相关的QTL，但仔细分析发现这些QTL都位于已知的调控生育期的染色体区段内[12]。也就是说，稻米镉积累的QTL位点和生育期控制位点可能存在连锁累赘，或者属于一因多效的同一位点。与之一致的是，我们实验室也发现有低镉基因与生育期基因存在连锁累赘现象。但是，稻米镉积累和生育期控制都是有多基因控制的数量性状，个别基因的连锁并不代表二者的性状一定存在相关性。最近Sun[2]和Duan[13]分别调查了617个和471个品种的稻米镉积累与生育期的关系。Sun利用全生育期干湿交替的方法排除水分管理模式干扰，在这种情况下，二者之间具有一定的相关性，但相关系数较低[2]。而Duan采用常规的水分管理模式，即中期晒田和成熟期断水，结果发现稻米镉积累量与生育期显著正相关[13]。因此，稻米镉积累量是否与生育期成正相关还需要更多的试验数据支持。不过需要指出的是，即使生育期相同，稻米镉积累量也有较大的差别，筛选和培育镉低积累品种不受生育期和产量的限制。

1.4 镉低积累水稻品种的类型及其遗传力

杂交稻具有广泛的杂种优势，其较高的肥水利用效率使人们直觉地认为杂交稻的稻米镉含量也较常规稻高。因此，很多人认为重金属低积累品种主要在常规稻中，而杂交稻的稻米镉含量则相对较高，没有镉低积累品种。2014—2016年，我们以617份长江中下游主栽籼稻杂交稻品种、68份来源广泛的常规稻品种为试验材料，进行了稻米镉含量的比较分析[2]。总体来看，杂交籼稻与常规籼稻亚群镉含量无显著差异（P＞0.05），与常规粳稻亚群镉含量差异显著（P＜0.01）。杂交稻与其亲本间的籽粒镉进行比较，未发现统一规律，既存在杂交稻比其亲本（父本）稻米镉含量高的品种，也存在低的或相差不大的品种，表明杂交稻稻米镉含量不一定比亲本高。在比较杂交稻籽粒镉含量与常规稻各亚群及不同生态型籽粒镉含量的差异时，我们发现杂交籼稻群体籽粒镉含量与籼稻亚群相近。因此，镉低积累品种的筛选培育与品种类型无关，而主要是其遗传背景决定的。

根据双因素方差分析，以水稻基因型和大田土壤污染作为两个参考因素，我们分析了87份材料在4个不同污染大田中稻米镉含量表型变异，发现相对于水稻基因型，大田土壤污染是决定水稻稻米镉含量的主要因素，占表型变异的61.4%，而基因型则只决定了表型变异的16.5%。但是在相同的或相似的大田污染环境下，水稻稻米镉含量变异则主要受其基因型的控制，达到极显著水平（4个土壤污染环境下P＜0.001）。这说明，在不同的污染环境下，水稻稻米镉含量主要由环境决定，而在相同或相似的污染环境下，水稻基因型决定了稻米镉含量表型的变异。

2 镉低积累品种的筛选认定方法

由于目前筛选和认定重金属低积累品种的方法较多，如排序法，分级法，富集系数法等，人们对镉低积累品种的筛选、认定还没有形成统一的标准。各种方法都有一定的合理性，但也有不少争论。主要争议在于：1）没有对照品种，2）基因型差异最大化与国家稻米镉安全标准限值的矛盾。从筛选最终目标来说，我们筛选重金属低积累品种是稻米镉积累量相对较低，在一定条件下能达到国家安全限值标准的品种。但是稻米镉积累量随环境变化而变化，是一个连续的动态变化的正态分布曲线。与硬质小麦镉低积累品种的表现类似（图1A），当稻米镉积累量总体较大时，基因型差异则较大。随着整体稻米镉积累量的降低，稻米镉积累基因型差异也会减少，并且环境变化导致的差异会掩盖基因型差异（图1B、图1C）。无论安全标准是0.2 mg/kg还是0.4 mg/kg，都是一个人为的限量标准，而水稻作为一个生物体并不认识这样一个标准。随着土壤水分、pH值、土壤理化性质等环境条件的变化，土壤有效态镉会随之变化，从而最终改变稻米镉的积累量。因此，在镉低积累品种筛选和认定时要求一次实验既能分辨出各品种镉积累量基因型差异，又要确保目标品种的稻米镉积累量不超标是一件非常困难的事情。因此，我们建议根据稻米镉积累基因型差异的特点，以目前表现稳定的镉低积累品种为对照，先在较高的镉污染土壤条件下筛选出镉积累量相对较低的品种，然后在较低镉背景下评价其超标频率，明确其安全生产所需的环境条件，最终认定高镉污染条件下稻米镉含量相对较低、中低镉污染条件下能达标、而达标土壤条件下不超标、多重环境条件下表现稳定的低积累品种作为镉低积累品种。

图 1 镉高、低积累品种或近等基因系在不同土壤镉浓度条件下的籽粒镉积累差异Fig. 1 Grain-Cd concentrations varied according to soil-Cd level

3 筛选的镉低积累品种

稻米镉积累具有广泛的基因型差异，品种不同，其对镉的吸收，转运和分配能力会有差异，因此利用稻米镉积累的基因型差异，从已有的稻种资源中筛选镉低积累品种是生态学家和生物学家的首要选择[9-12]。由于镉低积累品种筛选过程耗时较长，加上水稻品种更新较快，所以虽然镉低积累品种筛选的研究报告较多，但商业化应用的还很少。目前只有个别突变体和湖南推荐的应急性镉低积累品种在重金属污染农田治理实践中得到应用。

水稻镉吸收主要通过锰离子转运蛋白NRAMP5进行，Ishikawa等[12]利用碳离子束辐射诱变（Carbon ion-beam irradiation）越光（Koshihikari）获得3株NRAMP5基因突变体，这三个突变体稻米镉含量在镉污染条件下显著降低（0.05 mg/kg VS 1.73 mg/kg），其中两株在农艺性状和经济产量指标方面没有明显的差异[14]。最近，Tang等[15]也获得了该基因在华占等背景下的基因敲除突变体，考种数据表明该基因能够降低镉含量，对农艺性状和除锰以外的其他微量元素的含量影响不明显[15]。但是，NRAMP5是水稻吸收锰的主要通道，这些突变体的锰含量也显著降低。由于锰是必需元素，该基因在中花11背景下突变体的生长发育受阻，生物量和籽粒产量显著降低[3]，因此，敲除该基因是否会造成农艺表型方面的变化需要更为广泛的试验验证。如果最终证明某些水稻材料能耐受较低水平的锰，或者这些材料的NRAMP5敲除后，另外的一些基因能代偿性的增加锰的吸收而不增加镉的吸收量，则可以通过基因工程手段改造NRAMP5来大幅降低土壤镉污染带来的稻米镉超标风险。另外，还有两个有望成为低镉育种材料的突变体是lct1和lcd突变体[5,16]。LCT1（Low-affinity cation transporter 1）在膨大的维管束和散生维管束中表达，将叶片和茎节中的镉向籽粒转运。RNAi干扰表达后该植株的镉含量能降低到原来的一半，但农艺性状和其他微量元素含量没有变化[5]。lcd是一个水稻Tos17插入突变体，该基因突变后即能增加水稻对镉的抗性，也能减少稻米的镉含量[16]。这两个基因的突变体都有望整合到主栽品种中用于镉低积累品种培育，但它们实际效应的大小还有待于更广泛研究。

从2014年开始，湖南开始大规模筛选低镉主栽品种，通过多年、多点、多重复的大田试验及盆栽试验，先后从685个主栽品种中筛选出了49个镉积累相对较低的品种作为应急性镉低积累品种。这些低积累品种两年内在安全利用区推广应用累计达40万hm2（表2）)。另外，2017年Duan等[13]面向全国推荐了8个镉低积累品种。上述品种都是目前市场占有率较高的品种，很多具有高产、高抗、优质、低镉的特性。这些品种有很多共性：早稻主要是株两优系列，共9个；中稻C两优系列和Y两优系列各4个，深两优系列3个；晚稻C两优系列6个，深优系列和金优系列各3个，H优系列2个。追溯筛选出的镉低积累水稻品种母本的共同来源发现，三系不育系主要来源于菲改B，两系不育系主要来源于株1S和培矮64S；父本来源较广，其中与三个以上品种有亲缘关系的亲本有：蜀恢527（12个品种）、先恢207（4个品种）、明恢63（4个品种）、岳恢9113（4个品种）、绵恢725（3个品种）、丰优早11（3个品种）。这些共同来源亲本，可能是水稻低镉基因的来源，在育种和低镉基因资源挖掘方面具有重要价值。

表2 筛选界定的镉低积累水稻品种名录Table 2 The list of low-Cd mega-rice variety

4 低累积水稻品种的定向培育

4.1 两个低累积作物品种选育的成功案例

稻米镉超标是最近才引起关注的现象，以往水稻育种家并不关注稻米重金属含量这一性状，所以目前很少有低镉水稻品种定向培育的成果报道。但是，水稻并不是第一个遭遇品质危机的作物，低镉向日葵和低镉硬质小麦的培育过程或许可以为镉低积累水稻品种定向培育提供借鉴经验[17]。1992年，德国制定了0.6 mg/kg的向日葵镉含量标准，这使得产自美国North Dakota州和Minnesota州的食用型葵花籽达不到安全条件。这两个州的土壤是细沙壤土，排水不畅，含有较多的氯离子，因此镉的有效性较高，产出的食用葵花籽的镉平均含量为1.33 mg/kg。Li等[18]通过对200份种质资源的筛选（1994年），筛选出了2个镉低积累品种Primrose和HA290，及两个镉含量中等的保持系HA323和恢复系RHA324。通过筛选HA323/HA290的后代，筛选出两个低镉新品种HA448和HA449。从RHA324/Primrose的后代中筛选出了RHA450恢复系。HA448/RHA450和HA449/RHA450 杂交种在2000—2002年三年实验中的平均镉含量降低50%以上[19]。硬质小麦比普通小麦累积更多的镉。加拿大于1991年启动了低镉硬质小麦育种计划。在最初的资源调查中发现了Hercules及其衍生品种Arcola的籽粒镉含量相对较低，其中Arcola的镉含量只有当时的主推品种Kyle的一半[17]。随后的遗传学研究发现籽粒中的镉含量受到一对低镉显性基因的调控，并被定位到5B染色体上[20]。通过回交育种的办法将该低镉位点导入到5个高产品种中，这些近等基因系除了镉能降低2.5倍外没有其他差异。近等基因系间的差异大小随环境的变化而变化，当整体籽粒镉含量相对较低时二者差异相对较小，反之则较大（图1）[21]。2004年世界上第一个商业化推广的低镉硬质小麦品种“Strongfield” 获得认定[22]，其现在的推广面积已经达到加拿大25%以上的硬质小麦种植区。现在加拿大新审定推广的硬质小麦必须具有低镉特性[17]。

4.2 低累积水稻品种定向培育的阶段性成果

从2014年开始，我国湖南启动了镉低积累水稻育种计划，几乎湖南所有与育种相关的单位都参与到这一过程。由于稻米镉积累的性状不能直接进行田间鉴定，且受环境影响较大，各参与单位所取得的进展并不一致。但总体而言，该育种计划已经获得初步成功，目前已有一大批高产、低镉新品系和新组合正在参与品种预试和区试，镉低积累品种板仓粳糯通过了品种审定（湘审稻20170012）。经验表明，结合重金属积累遗传调控方面的基础研究成果、育种家的育种经验以及种业公司的商业化育种平台能够快速推进镉低积累品种定向培育工作。分子育种手段具有一定的优势，其可以节约筛选成本，提高筛选效率。我们利用自己开发的4个低镉分子标记，对已经定型的5 769份具有籼粳杂交背景的父母本新品系进行分子标记辅助选择，筛选到携带1-3个低镉分子标记的464S、141S等8份两系不育系和R772、R051等72份父本新品系。2015年从72份父本材料中选取代表性的新品系14份参加多点镉积累特性联合鉴定试验，其结果是目标选育品种的稻米镉含量在整体参测品种中表现良好，低中更低。表3为部分品系的综合表现，从中可以看出，这些品种已经具有了高产、高抗、质优、低镉的特征。由于杂交组合的镉积累受双亲遗传控制，以加性效应为主[23]，这些新品系配置的组合也表现出稳定的低镉特征（表3）。

表3 新育成的代表性低镉恢复系及组合的田间表现Table 3 performance of newly-developed low-Cd restorer lines and their combinations

5 展望

治理土壤重金属污染是一项长期艰巨的任务，推广镉低积累水稻品种能有效降低稻米镉超标的风险。筛选和培育出一批低镉、高产、高抗、优质的主栽品种是育种家和农业环境保护工作者长期努力的目标。低镉基因挖掘和种质创新、低镉新品种培育与认定、镉低积累品种分级及生态适应性区间划分是今后一段时间的工作重点。

低镉基因挖掘和种质创新是镉低积累水稻育种的基础，需要利用自然群体和人工创制的遗传群体，开展全基因组关联分析和基因定位研究，寻找低镉基因资源及其紧密连锁的分子标记。在此基础上进一步精细定位和克隆低镉功能基因。解析主栽品种中相关功能基因的等位变异规律，筛选优异等位基因变异，开发功能性低镉分子标记。建立镉低积累水稻分子辅助育种技术体系，有效提高镉低积累水稻新品种选育效率。将筛选到的低镉基因，利用杂交、回交育种手段和MAS育种技术聚合到有价值的育种资源中；利用分子标记技术，直接从农艺性状稳定的镉低积累材料中筛选含有已知低镉基因的新材料；对筛选获得的镉低积累材料进行多年多点的镉积累特性鉴定和其他农艺性状评价，获得具有育种应用潜力的稳定低镉材料。

低镉新品种培育与认定是镉低积累水稻育种的核心。低镉新品种培育可以通过三种途径实现，即定向改良高产高镉品种、定向改良低镉低产品种、低镉高产杂交组合后代筛选。高产高镉品种改良是将低镉积累等位基因转育到现有高产高镉骨干亲本中，培育常规稻新品系、杂交稻新组合。而低镉低产品种改良是将控制产量性状的基因Gn1a、Ghd7、RH8[24-26]的优秀等位基因型定向聚合到低镉目标品种中，筛选高产、镉低积累水稻新品种。低镉、高产杂交组合后代筛选是结合传统的田间鉴定和分子标记，从高产低镉杂交后代中筛选稳定的目标株系。通过多年多点的镉积累特性鉴定和其他农艺性状评价，最终选育低镉、优质、多抗、高产、广适型新品种，区试产量、品质和抗性指标符合现行品种审定要求，稻米镉超标风险显著降低。

稻米镉积累受环境因子和遗传因子的共同影响，每一镉低积累品种都有独特的遗传特点，因此，它们的生态适应性区间也各有不同。建立镉低积累品种分级体系及明确各品种生态适应性区间（土壤镉浓度，pH值等）是镉低积累品种选育的难点。如何对镉低积累品种进行精准表现鉴定，建立一套简单易行、可操作性强、稳定可重复的水稻镉积累特性表型鉴定标准与分级评价体系，确立低镉新品种审定的地方标准或国家标准是低镉育种必须跨过的门槛。