金银花黄酮类提取物对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

， ， ，仁英

心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是多种心脏疾病发展至终末期的共同病理改变，可致心室顺应性和收缩功能下降而发生心力衰竭[1-2]。心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CF)是MF的主要因素，MF主要是由于CF增殖和胶原蛋白的过量表达、分泌和堆积的结果[3]。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是目前公认的促心肌纤维化因素，可引起CF增殖和胶原蛋白合成，从而导致心肌纤维化[4]。

金银花(Lonicerae Flos)，又名双花、忍冬花，为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的干燥花蕾或带初开的花，为常用中药，药用历史悠久[5]。黄酮类化合物(flavonoids)为金银花的有效成分之一，有研究表明黄酮类化合物具有良好的抗氧化、清除自由基、抗炎及调节心血管系统等作用，对冠心病、心绞痛、心血管疾病有较好效果[6-7]，但金银花黄酮类化合物对CF的增殖及其作用机制研究甚少。本研究观察金银花黄酮类提取物对AngⅡ诱导的大鼠CF的增殖及Ⅰ型胶原合成的影响，探讨金银花黄酮类提取物抗MF的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 出生2 d～3 d的SD大鼠，SPF级，雌雄不限，由中山大学北校区实验动物中心提供。

1.1.2 实验药品与试剂 金银花药材：购自亳州市京皖中药饮片厂，经鉴定为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花；血管紧张素Ⅱ(Sigma公司)；杜氏改良Eagle(DMEM)培养基(GIBCO公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；胰蛋白-EDTA消化液(GIBICO公司)；二甲亚砜(Sigma公司)；Ⅰ型胶原蛋白一抗(美国Cell Signaling Technology公司)；二抗羊抗兔IgG(美国LI-COR Biosciences)；十二烷基硫酸钠-聚丙烯硫胺凝胶配制试剂盒和二辛可宁酸蛋白浓度测定试剂盒(武汉谷歌生物有限公司)；RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒及逆转录-聚合酶链反应试剂盒(TaKaRa公司)；引物由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司设计并合成；细胞计数(CCK-8)试剂盒(日本同仁研究所)；细胞周期检测试剂盒(南京凯基生物)；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 实验仪器 AG135分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；组织匀浆机(德国 IKA 公司)；超净工作台(苏州集团安泰空气技术有限公司)；CB150 CO2细胞培养箱(德国Binder)；CKX41倒置显微镜(OLYMPUS)；全自动酶标仪(美国 Metertech公司)；流式细胞仪(美国BD Biosciencesl)；电泳仪及电泳槽(北京六一厂)；Heraeus Fresco 21低温微量离心机(德国Thermo)；Odyssey双色红外激光成像系统(LI-COR)；Nano Drop 2000c 紫外分光光度计(美国Thermo Scientific公司)；普通RT-PCR仪(东胜创新生物科技有限公司)；7500实时荧光定量PCR仪(ABI)。

1.2 实验方法

1.2.1 金银花黄酮类提取物的提取 准确称取干燥后的金银花50 g，粉碎过60目筛，加入70%乙醇500 mL，60 ℃水浴作用4 h，超声波细胞粉碎机作用15 min(600 W，超声1 s，间隙5 s)；60 ℃水浴，索氏回流提取器回流2 h；60 ℃真空旋转蒸发至50 mL，提取物浓度相当于1 g/mL，经薄层层析检验处于标准品芦丁黄酮类相应位置，紫外灯下显相同荧光。115 ℃、15 min高压灭菌，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 新生大鼠CF的分离、培养 取2 d～3 d的SD大鼠，无菌条件下开胸取出心室，采用预冷的D-Hanks液清洗，将其剪碎，用0.25%胰酶消化液反复消化(37 ℃恒温摇床摇动10 min～15 min)，直至组织块消失，收集每次消化上清液，加等量含20%胎牛血清的DMEM培养基，离心弃上清，取沉淀加含10%胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，接种培养瓶中，置37 ℃、5% CO2培养箱内培养。根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁40 min，弃上清去除心肌细胞，获得CF，待CF生长接近融合90%时，胰酶消化传代，实验采用2代～4代CF。

1.2.3 实验分组 实验细胞共分为5组，空白对照组：含1%胎牛血清DMEM培养基；AngⅡ模型组：含AngⅡ1.0×10-7mol/L；AngⅡ+金银花黄酮类提取物低剂量(200 μg/mL)组；AngⅡ+金银花黄酮类提取物中剂量(400 μg/mL)组；AngⅡ+金银花黄酮类提取物高剂量(600 μg/mL)组。

1.2.4 CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖情况 取对数生长期CF每孔1× 104个细胞接种于96孔板中，37 ℃、5%CO2及饱和湿度下培养24 h后更换无血清培养基，继续培养24 h后，使细胞进入生长静止期。吸各孔培养基，按实验分组对各组细胞进行处理，继续培养，48 h后取出96孔板，每孔加入CCK-8溶液20 μL，继续孵育30 min。酶标仪测定450 nm处各孔的吸光值(A)。

1.2.5 流式测细胞周期 取对数生长期CF于37 ℃、5%CO2及饱和湿度下培养，24 h后更换无血清培养基，继续培养24 h后，使细胞进入生长静止期。吸弃各孔培养基，按实验分组对各组细胞进行处理，继续培养48 h后，收集细胞，将细胞悬液以1 000 r/min离心5 min，去上清，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)重悬润洗后，缓慢加入700 μL预冷的80%乙醇，使乙醇终浓度为70%，4 ℃固定4 h以上，1 000 r/min离心5 min，用预冷的PBS润洗2次，加入100 μL RNaseA(50 μg/mL)，37 ℃水浴30 min，加入400 μL 碘化丙啶(50 μg/mL)，4 ℃避光染色30 min，流式细胞仪上机检测细胞周期，重复3次。

1.2.6 免疫印迹法(Western blot)测定相对蛋白表达量 取对数生长期CF于37 ℃、5%CO2及饱和湿度下培养，24 h后更换无血清培养基，继续培养24 h后，使细胞进入生长静止期。吸弃各孔培养基，按实验分组对各组细胞进行处理，继续培养48 h后，收集细胞，PBS轻轻洗涤2次，加入放射免疫沉淀实验裂解液提取细胞总蛋白，二辛可宁酸法测定提取的蛋白浓度。加上样缓冲液，100 ℃加热煮沸7 min。每组取20 μg总蛋白上样，利用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各组细胞蛋白质，电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。PVDF膜用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜。三羟甲基丙氨酸缓冲液(TBST)洗涤3次，二抗室温摇床上慢速孵育1 h，TBST洗膜3次，利用Odyssey成像系统对PVDF膜进行扫描分析，检测各组细胞的蛋白条带的灰度值，计算其相对蛋白表达量。

1.2.7 总RNA的提取 收集对数期生长状态良好的细胞，按照Trizol RNA提取试剂盒操作说明提取总RNA。加入1 mL Trizol吹打使细胞滑落并充分裂解，静置15 min；加入氯仿(Trizol：氯仿5∶1)，剧烈振荡颠倒数次混匀，室温静置15 min。4 ℃，12 000 r/min 离心15 min。小心转移上清液于无酶离心管中，加入与上清等体积的异丙醇上下颠倒混匀，室温静置10 min，4 ℃，12 000 r /min离心15 min，弃上清液，加入1 mL 预冷的75%乙醇，洗涤RNA。4 ℃，7 500 r /min离心10 min，重复1次。晾干至半透明，加入适量无核酸酶水-焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA，紫外分光光度计测定浓度及纯度，于-80 ℃保存备用。

1.2.8 实时定量RT-PCR检测细胞内Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达量 取合格RNA样品2 μg进行逆转录，以oligo dT为引物，采用逆转录试剂盒进行逆转录，然后取同一批cDNA 5 μL用于PCR反应扩增目的基因。引物序列如下：β-actin上游引物5′-ACCTTCAACAACCCAGCCATGTACG-3′，下游引物：5′-CTGATCCACATCTGCTGGAGGGTGG-3′；Ⅰ型胶原蛋白上游引物：5′-ATGGCTGCACGCACGAGTCACAC-3′，下游引物：5′-GTCTGGGGCACCAACGTCCA-3′。RT-PCR反应条件为：95 ℃，30 s，1个循环；95 ℃，5 s，60 ℃，34 s，共40个循环。反应在96孔板中进行，每个样品设3个复孔，共包含20 μL的反应体系。反应结束后得到各组的目的基因和内参的CT值，进行标准化处理，使用ΔΔCT法分析RT-PCR所得数据，根据公式计算2-△△CT，(ΔCT=CT目的基因-CT内参，ΔΔCT=ΔCT实验组-ΔCT对照组)，计算得到mRNA的相对表达量，进行统计学分析并作图。

2 结 果

2.1 金银花黄酮类提取物对AngⅡ诱导CF增殖的影响 CCK-8检测结果显示：AngⅡ作用48 h后可显著提高CF增殖率，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；金银花黄酮类提取物作用48 h后，与AngⅡ模型组比较，AngⅡ+金银花黄酮类提取物高剂量、中剂量、低剂量组CCK-8的吸光度值明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；且AngⅡ+金银花黄酮类提取物高剂量组与中剂量、低剂量组比较CCK-8的吸光度值显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)，表明金银花黄酮类提取物抑制CF的增殖作用具有一定的剂量依赖性。详见表1。

表1 金银花黄酮类提取物对AngⅡ诱导大鼠CF增殖的影响

2.2 金银花黄酮类提取物对AngⅡ诱导CF周期的影响 流式细胞仪检测结果显示：AngⅡ作用48 h后，AngⅡ模型组与空白对照组比较，S期和G2/M期细胞比例显著升高，G0/G1期细胞比例显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；AngⅡ+金银花黄酮类提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组与AngⅡ模型组比较，S期和G2/M期细胞所占比例呈剂量依赖性逐渐下降，G0/G1期细胞所占比例呈剂量依赖性逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.01)；金银花黄酮类提取物高剂量组与中剂量组、低剂量组比较，S期和G2/M期细胞显著下降，G0/G1期细胞比例显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表2。

表2 各组细胞各周期所占比例(±s) %

2.3 金银花黄酮类提取物对AngⅡ诱导CF中Ⅰ型胶原蛋白的影响 空白对照组、AngⅡ模型组和金银花黄酮类提取物高剂量、中剂量、低剂量组各组细胞内的Ⅰ型胶原蛋白的相对表达量分别为0.445±0.040，0.670±0.030，0.414±0.030，0.354±0.020，0.216±0.030。AngⅡ模型组与空白对照组比较，Ⅰ型胶原蛋白表达量显著提高，差异有统计学意义(P<0.05)；AngⅡ+金银花黄酮类提取物低剂量、中剂量、高剂量组与AngⅡ模型组比较，Ⅰ型胶原蛋白表达量显著下降并呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.01)；高剂量组与中剂量、低剂量组比较，Ⅰ型胶原蛋白表达量显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)。详见图1。

A为空白对照组；B为AngⅡ模型组；C为AngⅡ+金银花黄酮类提取物低剂量组；D为AngⅡ+金银花黄酮类提取物中剂量组；E为AngⅡ+金银花黄酮类提取物高剂量组。与空白对照组比较，*P<0.05；与AngⅡ模型组比较，#P<0.01；与AngⅡ+金银花黄酮类提取物高剂量组比较，△P<0.01

2.4 金银花黄酮类提取物对AngⅡ诱导CF Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达的影响 空白对照组、AngⅡ模型组和金银花黄酮类提取物高剂量、中剂量、低剂量组各组细胞内的Ⅰ型胶原蛋白mRNA相对表达量分别为1.00±0.00，1.86±0.21，1.31±0.14，1.13±0.03，0.95±0.03。AngⅡ模型组与空白对照组比较，Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达量显著提高，差异有统计学意义(P<0.05)；AngⅡ+金银花黄酮类提取物低剂量、中剂量、高剂量组与AngⅡ模型组比较，Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达量显著下降并呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.01)；高剂量组与中剂量、低剂量组比较，Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达量显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)。详见图2。

A为空白对照组；B为AngⅡ模型组；C为AngⅡ+金银花黄酮类提取物低剂量组；D为AngⅡ+金银花黄酮类提取物中剂量组；E为AngⅡ+金银花黄酮类提取物高剂量组。与空白对照组比较，*P<0.05；与AngⅡ模型组比较，#P<0.01；与AngⅡ+金银花黄酮类提取物高剂量组比较，△P<0.01

3 讨 论

MF主要表现为CF增殖、胶原沉积、细胞外基质蛋白聚集等，Ⅰ型胶原蛋白在心肌主要由CF合成和分泌，是MF乃至全身纤维化疾病发生发展的重要环节[8]。AngⅡ是CF的重要生长调节因子之一，它不仅可促进心肌细胞蛋白合成增加，而且促进CF增殖和Ⅰ型胶原蛋白合成增加，在促进MF的发生发展过程中发挥重要作用[9]。MF是临床多种心脏疾病发生发展的重要病理基础，导致心力衰竭、心律失常、心源性猝死等严重并发症[10]。因此，有效抑制CF增殖药物将可有效阻断此环节的发生，从而延缓或抑制心肌纤维化的发生发展。

黄酮类类化合物为金银花的有效成分之一，主要有木樨草素、葡萄糖苷、槲皮素、金丝桃苷等[11]。黄酮类类化合物具有良好的抗氧化、清除自由基、抗炎及调节心血管系统等作用，对冠心病、心绞痛、心血管疾病有较好效果[12]，但金银花中黄酮类类化合物对CF的增殖及其作用机制研究甚少，本研究通过观察金银花中金银花黄酮类提取物对AngⅡ诱导的大鼠CF增殖及Ⅰ型胶原蛋白合成的影响，探讨金银花中金银花黄酮类提取物抗MF的作用及其机制。

本研究采用AngⅡ刺激体外培养的CF，实验结果显示，与对照组比较AngⅡ明显促进CF增殖和Ⅰ型胶原蛋白的合成，具有促纤维化作用，这与徐朝军等[13]报道相似，金银花黄酮类提取物可明显抑制该作用。本研究结果显示，金银花黄酮类提取物对AngⅡ诱导的CF增殖具有明显抑制作用，且呈剂量依赖性。金银花黄酮类提取物可明显增加CF的G0/G1期细胞百分率，降低S期和G2/M期细胞百分率，阻滞CF细胞周期。表明金银花黄酮类提取物通过抑制CF增殖和阻滞CF细胞周期从而抑制心肌纤维化。另一方面，AngⅡ诱导后CFⅠ型胶原蛋白和mRNA表达均明显增加，加入金银花黄酮类提取物作用后其表达显著降低，且其抑制效应随着金银花黄酮类提取物作用剂量增加而加强，呈剂量依赖性，说明金银花黄酮类提取物通过抑制CF的胶原合成抑制心肌纤维化进程。

综上所述，金银花黄酮类提取物对AngⅡ诱导的大鼠CF增殖和胶原合成具有明显的抑制作用，具有抗纤维化作用，但其具体作用机制有待进一步研究。