环磷酰胺对大鼠烧伤后早期心肌中性粒细胞的表达及心功能的影响

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严重烧伤早期全身有效循环血量下降之前，心肌缺血缺氧损害及功能减退即已发生。魏在荣等[1]前期研究认为使用2.0 mg/kg～2.5 mg/kg低剂量环磷酰胺(CY)无明显细胞毒副作用，并具有抗炎和免疫调节作用，同时有研究表明低剂量CY具有保护心肌作用[2]。本研究为进一步研究烧伤后心肌保护机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物来源及分组 成年雄性清洁级SD大鼠(由第三军医大学动物实验中心提供)100只，体重160 g～200 g，适应性喂养于SPF级动物实验中心1周，体重增至210 g～270 g。随机分为4组：CY组(n=40)、烧伤组(n=40)、CY对照组(n=10)、空白组(n=10)。

1.2 动物模型制备 将SD大鼠烧伤前禁食12 h，称重，CY组与烧伤组按公式面积(S)(cm2)=12.5×W2/3(S为面积，W为体重)计算需烧伤的面积，于大鼠腹腔内注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)，麻醉成功后背部剃毛，划出致伤面积标志，8%硫化钠背部脱毛，待毛被溶解成淡绿色糊状时立刻用温水彻底清洗干净，3%凝固汽油涂抹于致伤范围内，用量约0.4 mL/10 cm2，湿布保护周围正常皮肤，点火燃烧致伤20 s制成30%体表总面积(TBSA)Ⅲ度烧伤。烧伤模型建立后，烧伤组大鼠立即腹腔注射乳酸林格氏液(50 mL/kg)，CY组大鼠立即腹腔注射乳酸林格氏液(50 mL/kg)和CY(2 mg/kg)；空白组和CY对照组仅背部剃毛和硫化钠脱毛，空白组大鼠于腹腔内注射生理盐水(50 mL/kg)，CY对照组大鼠于腹腔内注射生理盐水(50 mL/kg)和CY(2 mg/kg)。模型制作完成后所有大鼠自由饮食。所有实验大鼠均进入实验分析，无一只意外死亡。

1.3 标本采集及处理 CY组和烧伤组在建模成功后2 h、6 h、12 h、24 h时相点提前20 min各随机取10只大鼠，麻醉后颈动脉插管，而后缓慢将导管推入左心室，将插管导管接入RM6240B生理信号采集处理系统压力换能器通道，稳定5 min后，记录左心室收缩压(LVSP)，左心室终末舒张压(LVEDP)、左室压最大上升速率(dp/dtmax)、左室压最大下降速率(-dp/dtmax)、待以上步骤完成后，抽取腹主动脉血5 mL，经抗凝分离出血清保存于-80 ℃冰箱用于检测血清肌钙蛋白I(cTnI)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)。取血完成后大鼠放血处死，无菌条件下采集心脏组织，生理盐水漂洗5 min，洗去残留血液。心脏标本锡纸包裹后立即置入-80 ℃冰箱保存用于检测心肌组织髓过氧化物酶(MPO)。于24 h时相点同法测定空白组与CY对照组大鼠LVSP、LVEDP、dp/dtmax、-dp/dtmax，取空白组大鼠动脉血血清及心脏标本，取材方法同上。

1.4 主要实验试剂 MPO试剂盒(南京建成科技有限公司)；大鼠心肌cTnI酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海朗顿生物科技有限公司)；注射用乳酸林格氏液(四川美大康佳乐药业有限公司)；CY(江苏恒瑞医药股份有限公司)；生理盐水(武汉滨湖双鹤药业有限责任公司)。

1.5 检测指标

1.5.1 血流动力学及心肌力学指标监测 按RM6240B生理信号采集处理系统压力换能器使用说明读取数据。

1.5.2 心肌组织MPO测定 参照说明书步骤操作，使用721分光光度计检测(上海申化仪表自控公司)。取左心室心肌组织100 mg，剪碎后加入0.5%溴化十六烷基三甲基铵2 mL制备匀浆，超声细胞粉碎仪粉碎3次，每次10 s，应用低温离心机4 ℃、3 000 r/min离心15 min。取上清液0.1 mL并加反应液2.9 mL，旋涡混匀器混匀，于室温25 ℃保存，于紫外线分光光度计460 nm处测定2 min，记录30 s～90 s A值变化，1单位MPO活力以25 ℃每分钟分解1 μmoL H2O2表示，按下列公式计算：MPO(μg)=ΔA460 min÷[11.3×所加组织量(g)/反应液的量(L)]。

1.5.3 心肌cTnI测定 参照说明书操作：加入标准品、血清于反应板中，再加入酶联物，混匀并温育90 min，洗板，加显色液并温育20 min后加入终止液，确定蓝色变为黄色时，15 min内在450 nm处读D(450)值。

1.5.4 血浆CK-MB测定 采用全自动生化分析仪检测。

2 结 果

2.1 各组大鼠血流动力学及心肌力学参数比较 烧伤组大鼠血流动力学及心肌力学指标LVSP、LVEDP、dp/dtmax及-dp/dtmax从建模后2 h后开始降低，12 h达峰值，24 h开始升高，烧伤组2 h、6 h、12 h、24 h各时相点与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；CY组从建模后2 h后降低，6 h达到最低水平，12 h开始升高，24 h升高明显，2 h、6 h、12 h、24 h组与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；CY组与烧伤组比较，CY组从建模6 h开始升高，12 h升高较烧伤组明显，2 h、6 h、12 h、24 h各时相点两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；CY对照组与空白组各相应时相点比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠血流动力学及心肌力学参数比较(±s)

2.2 各组大鼠心肌组织MPO活性比较 烧伤组心肌组织MPO活性从建模后2 h后开始增高，6 h达峰值，12 h开始下降，24 h仍保持较高水平，2 h、6 h、12 h、24 h烧伤组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；CY组心肌组织MPO活性从建模后2 h增高，6 h达到较高水平，12 h开始下降，24 h下降明显，2 h、6 h、12 h、24 h CY组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；CY组与烧伤组比较，CY组心肌组织MPO活性从建模后12 h开始下降，24 h下降明显，2 h、6 h、12 h、24 h各时相点两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；CY对照组与空白组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠心肌组织MPO活性比较(±s) μg/mL

2.3 各组大鼠血清cTnI含量比较 烧伤组大鼠血清cTnI含量从建模后2 h后开始增高，12 h达峰值，24 h开始下降，2 h、6 h、12 h、24 h烧伤组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；CY组从建模后2 h增高，12 h达到较高水平，24 h下降明显，2 h、6 h、12 h、24 h CY组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；CY组与烧伤组比较，CY组大鼠血清cTnI含量从建模后12 h开始下降，24 h下降明显，2 h、6 h、12 h、24 h各时相点两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；CY对照组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠血清cTnI含量比较(±s) ng/mL

2.4 各组大鼠血清CK-MB含量比较 烧伤组大鼠血清CK-MB含量从建模2 h后开始增高，12 h达峰值，24 h开始下降，2 h、6 h、12 h、24 h烧伤组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；CY组从建模后2 h增高，12 h达到较高水平，24 h下降明显，2 h、6 h、12 h、24 h CY组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；CY组与烧伤组比较，CY组大鼠血清CK-MB含量从建模后12 h开始下降，24 h下降明显，2 h、6 h、12 h、24 h各时相点两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；CY对照组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠血清CK-MB含量比较(±s) U/L

3 讨 论

糖皮质激素类及非甾体类抗炎药物通过或部分通过抑制核转录因子-κB(NF-κB)活化达到抗炎目的，但这两类药物作用广泛，剂量要求较大，较高浓度时才能起到抑制NF-κB作用，其毒副作用对机体损伤较大[3]。国内外学者对大剂量糖皮质激素使用持有争论，王达利等[4]动物实验证实低剂量CY能减少炎症介质释放，血浆及各脏器内肿瘤坏死因子-α显著减少，并能延长实验动物的生存时间。有实验证实，低剂量CY可减轻心肌中性粒细胞浸润[2]。本实验CY对照组大鼠血流动力学、心肌力学参数、心肌组织MPO活性、CK-MB含量及血清cTnI含量与相应时相点空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)，该结果进一步表明低剂量CY对大鼠心肌细胞无明显细胞毒作用。

严重创伤发生时，中性粒细胞及单核细胞嗜天青颗粒释放MPO等过氧化物酶类，MPO活性反映多形核白细胞(PMN)的浸润数量，是评价炎症反应程度的重要指标[5]。严重创伤后机体内巨噬细胞(Mφ)凋亡逐渐增加，凋亡PMN被Mφ吞噬数量减少，PMN发生继发性坏死，细胞内容物释放MPO、氧自由基等炎性细胞因子，释放到心肌细胞外的MPO，导致氧化应激和氧化性心肌组织损伤[6]。本实验结果可见烧伤组大鼠心肌组织中MPO值明显增高，说明心肌组织PMN释放增多，证实心肌细胞损伤加重，心肌细胞损伤直接导致心功能降低。心肌cTnI和CK-MB为评价心肌损伤的指标，其血浆含量的变化与心肌的损伤程度呈平行关系[7]，其中分子量为2.4×104的cTnI是心肌特有，心肌细胞因缺血、缺氧等发生变性坏死时，cTnI通过破损细胞膜释放入血。cTnI分子量较小并持续从变性细胞内逸出，目前可视为判断心肌损伤特异和敏感指标[8]；CK-MB敏感性较强，但由于骨骼肌含有少量CK-MB，重度烧伤常伴有肌肉损伤，故其特异性稍差。本研究烧伤组和CY组血浆cTnI及CK-MB含量2 h后开始增高，12 h达峰值，进一步佐证心肌功能的损伤。CY组各相应时相点大鼠的心肌组织MPO含量较烧伤组显著降低，同时CY组大鼠血清cTnI及CK-MB含量较烧伤组明显降低。大鼠血浆cTnI及CK-MB含量变化与大鼠心肌组织中MPO含量呈平行关系，证实低剂量CY可有效减轻心肌组织的炎症反应，保护心功能。

经过大量研究发现心肌损伤在严重烧伤早期即已出现，由于烧伤局部和其他部位血管通透性增加，血浆大量渗出至第三间隙，造成有效循环量锐减，心肌由于灌注不足引起缺血缺氧、炎症损伤等导致心脏产生一系列相互关联的反应，最终加重休克致死亡[9]。心肌力学是应用心肌张力、长度和收缩、延长速度等力学特性为参数表达心肌舒张及收缩性能[10]。本实验结果显示，烧伤组大鼠烧伤后2 h开始LVSP、LVEDP、dp/dtmax及-dp/dtmax均明显降低，12 h达峰值，提示严重烧伤早期即存在心肌收缩舒张功能下降，且舒张功能下降的发生时间早于收缩功能发生障碍时间[11]。进一步观察发现CY组大鼠烧伤后LVSP、LVEDP、dp/dtmax及-dp/dtmax均较烧伤组明显降低。推测是由于低剂量CY减轻心肌组织PMN浸润，减轻心肌炎症反应，降低心肌缺血缺氧损害，进而起到保护心肌细胞，增强心功能的作用。

综上所述，低剂量CY能显著增加严重烧伤大鼠心脏的血流量，增强心肌收缩和舒张功能，抑制心肌细胞MPO释放，降低烧伤血浆中cTnI及CK-MB含量，具有明显的心肌保护作用，但其确切机制有待进一步实验研究。