胆汁酸代谢异常与肝硬化并发胆囊结石的关系分析*

2018-11-26高聪张宇陈云飞刘兵

西部医学 2018年11期

高聪张宇陈云飞刘兵

(四川省医学科学院·四川省人民医院 1.急诊外科，2.肝胆外科，四川成都 610072)

肝硬化是饮食、精神状态及代谢性疾病等致病因素长期反复作用于肝脏导致的慢性肝损害，患者易并发胆囊结石。在我国，胆囊结石发病率约为10%，而肝硬化并发胆囊结石患者因全身状况不佳不允许手术，药物治疗疗效差或反复发作，因此预防肝硬化患者发生胆囊结石需从其病理方面深入研究[1-2]。胆汁中成分改变为胆囊结石形成的重要原因，当胆汁酸减少时，可直接或间接影响胆汁中胆固醇状态，形成结石[3]。胆汁中胆汁酸、磷脂、直接胆红素(Direct bilirubin,DBIL)等的分泌受法尼醇受体(FXR)、胆盐输出泵(BSEP)、多耐药相关蛋白(MRP)的调节，其中FXR作为胆汁酸受体可调节胆汁酸合成、转运、代谢及重吸收，减少胆汁淤积[4-5]。Wang YD等[6]的研究发现，肝脏细胞中的胞质为BSEP的储存库，其BSEP量为肝细胞胆管侧膜的6倍，体内BSEP主要通过肝细胞胆管膜转运胆盐，而减少肝脏内胆汁潴留、瘀积，且FXR可调节BSEP、MRP活性[7]。因此，本研究在既往研究基础上，推测FXR、BSEP、MRP引起的胆汁酸代谢异常可能与肝硬化并发胆囊结石有关，旨在为预防肝硬化并发胆囊结石提供病理依据，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料纳入2015年4月～2017年5月我院收治的肝硬化并发胆囊结石患者40例、单纯胆囊结石患者36例。纳入标准：①肝硬化患者依据肝炎病史及血清乙肝病毒感染标记阳性，且具有肝硬化临床表现、生化与影像学辅助检查证实为肝硬化，并于术中行肝脏活检，病理证实为肝硬化。②所有患者均经CT或腹部超声明确有胆囊结石。③麻醉分级(ASA)Ⅰ～Ⅱ级，且同意术后留取标本并签署知情同意书。排除标准：①梗阻性黄疸、合并胆总管结石、肝内胆管结石及其他胆道疾病者。②有肝切除术或胆道手术史。③合并全身免疫系统疾病或近1周服用过熊去氧胆酸、利胆药者。将肝硬化并发胆囊结石患者纳入研究组，单纯胆囊结石患者纳入对照组，研究组中男性18例，女性22例，年龄18～60岁，平均(38.56±4.11)岁，ASA分级：Ⅰ级21例，Ⅱ级19例；对照组中男性17例，女性19例，年龄19～58岁，平均(38.50±4.15)岁，ASA分级：Ⅰ级19例，Ⅱ级17例，两组在性别、年龄、ASA分级等一般资料方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究征得我院医学伦理委员会批准通过。

1.2 研究方法

1.2.1 术前检查及标本采集均于手术前1d抽血化验生化全项目，统计其总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、总胆汁酸(TBA)，术中切取肝缘约1.0cm2肝组织，采集标本后立即保存于福尔马林液中，并在24h内制成石蜡切片。

1.2.2 主要试剂及配制兔抗人FXR多克隆抗体(浓缩型，工作液浓度1：100)，兔抗人BSEP多克隆抗体(浓缩型，工作液浓度1：100)，兔抗人MRP2多克隆抗体(浓缩型，工作液浓度1：80)，均购自北京奥森生物技术有限公司；SP试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.3 FXR、BSEP、MRP2表达水平测定以4%多聚甲醛固定，铜制模具包埋组织块，后切片、脱蜡、阻断内源性过氧化物酶活性、抗原修复、甩去多余液体、滴加第一抗体、滴加生物素化第二抗体、滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液、DAB显色、苏木素复染细胞核7(8s，后置于×400倍显微镜下观察。应用美国IMAge-Pro Plus v5.1软件，捕获显微镜采集的组织形态学图片，选取其中阳性表达最强的5个视野进行计算，记录阳性细胞数及阳性细胞显色强度，得出SP评分(IHS)的数值。SP免疫组化图像评分标准：①阳性细胞数分级：0.0%～1%计0分，1%～10%计1分，11%～50%计2分，51%～80%计4分，81%～100%计4分。②阳性细胞显色强度：0分：未染黄色，阴性；1分：淡黄色，弱阳性；2分：黄色，阳性；3分：棕黄色，强阳性；IHS评分为①、②评分乘积。

1.3 观察指标 ①对比两组术前一天血清TBIL、DBIL、TC、TG、TBA水平。②比较两组肝脏组织FXR、BSEP、MRP2表达水平。③分析上述指标相关性。

2 结果

2.1 两组血清TBIL、DBIL、TC、TG、TBA水平比较与对照组比较，研究组DBIL、TBA明显较高，TC、TG较低(均P<0.05)，而TBIL对比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组血清TBIL、DBIL、TC、TG、TBA水平比较Table 1 The levels of serum TBIL, DBIL, TC, TG and TBA in the two groups

2.2 两组肝脏组织FXR、BSEP、MRP2表达水平比较研究组肝脏组织FXR、BSEP、MRP2表达水平均明显低于对照组(P<0.05)，见表2。

2.3 血清生化指标FXR、BSEP、MRP2相关性分析结果显示，肝硬化并发胆囊结石患者FXR、BSEP、MRP2与DBIL、TBA呈负相关，且FXR与BSEP、MRP2均存在正相关关系(P<0.05)，见表3。

Table2LivertissueFXR,BSEPandMRP2expressionlevelsinthetwogroups

组别nFXRBSEPMRP2研究组402.15±0.344.21±0.514.35±0.56对照组369.21±1.029.24±1.129.81±1.06t41.32525.61928.474P0.0000.0000.000

表3 血清生化指标FXR、BSEP、MRP2相关性分析Table 3 Correlation analysis of serum biochemical indexes, FXR, BSEP and MRP2

2.4 SP染色结果研究组局部肝细胞水肿，脂肪变性，结缔组织增生，炎细胞浸润，主要定位于细胞质中，细胞核也有少量表达，且研究组FXR、BSEP、MRP2表达均低于对照组，见图1～3。

图1 研究组、对照组FXR SP染色(×400)Figure 1 FXR SP staining in the study group and control group (x400)注：a为研究组，b为对照组

图2 研究组、对照组BSEP SP染色(×400)Figure 2 BSEP SP staining in the study group and control group (x400)注：a为研究组，b为对照组

图3 研究组、对照组MRP2 SP染色(×400)Figure 3 MRP2 SP staining in the study group and control group (x400)注：a为研究组，b为对照组

3 讨论

胆囊结石为临床外科常见病，患者常因胆绞痛、急性胆囊炎而就诊，严重者可出现胆囊坏疽、穿孔，胆囊结石一旦进入胆总管内，可致急性胆管炎、急性胰腺炎等，严重者危及生命[8]。胆囊结石的发生与肝硬化程度及病程密切相关，王子晨等[9]的调查结果显示，肝硬化患者合并胆囊结石发生率为21.3%，明显高于正常体检者单纯胆囊结石发生率的5.6%，且肝功能分级、DBIL、TG等是肝硬化并发胆囊结石的危险因素，因而探讨肝硬化患者并发胆囊结石的发病机制有助于改善其肝功能，减少结石形成率[10]。胆汁酸为胆汁重要成分，经肝脏合成后分泌至胆囊或肠道中，正常情况下胆汁中胆固醇、胆汁酸及磷脂维持一定比例的动态平衡，而肝硬化时，肝细胞受损，肝内酶不足，胆固醇向胆汁酸转化减少，使胆汁酸分泌减少，胆汁酸的减少也会使胆固醇溶解降低，胆固醇从胆汁中析出结晶，形成胆固醇结石，同时胆汁酸也是胆红素重要助溶剂，胆汁酸含量降低时将影响胆汁中游离胆红素溶解度，使胆汁酸与钙离子结合力减小，继而形成胆色素结石，因此肝硬化患者胆汁中胆汁酸浓度的改变为胆囊结石形成创造了条件，对研究胆汁酸代谢异常机制有重要意义[11-12]。胆汁形成及分泌与肝细胞转运蛋白密切相关，其中一些蛋白如转运胆盐的转运子BSEP、MRP2等在胆囊结石形成中的作用已在动物实验中得到充分印证[13-14]，但BSEP、MRP2与人体胆囊结石尤其是肝硬化并发胆囊结石的关系研究较少[15]。孔凡民等[16]的研究发现，胆囊结石患者的肝组织中BSEP、MRP2表达较正常肝组织减少，光密度平均值分别为(0.47±0.18)、(1.12±0.39)，提示BSEP、MRP2在人体胆囊结石形成中发挥作用。FXR则是主要表达于肝脏的典型核受体结构，DNA结合域与靶基因上FXR反应元件结合后发挥转录调节作用，其活化可负反馈调节胆汁酸合成，Liu J等[17]在分析胆汁酸对原代肝细胞胆汁酸合成和转运基因表达的影响时发现，在胆汁酸限速酶存在时，FXR作为主要靶基因有增加趋势，同时胆汁酸吸收转运Na+牛磺胆酸共转运多肽不受影响，而BSEP提高了15倍，MRP2也增加，可见FXR、BSEP、MRP2均可能参与胆汁酸代谢调控。

本次研究在既往研究基础上，分析了肝硬化合并胆囊结石患者(研究组)、单纯胆囊结石患者(对照组)在术前一天血清生化指标及FXR、BSEP、MRP2表达水平。结果显示，研究组血清DBIL、TBA明显高于对照组，而TC、TG明显低于对照组，且研究组FXR、BSEP、MRP2均较对照组低，这与张亮亮等[18]的报道结果相近，证实肝硬化并发胆囊结石患者存在明显的胆汁酸代谢异常。原因在于肝细胞血窦面基底膜上转运蛋白，包括有机阴离子、BSEP、MRP2等转运胆汁相应成分进入肝细胞内，再经与蛋白质结合或细胞内扩散方式运输至肝细胞毛细胆管膜，后进入毛细胆管内，形成胆汁；当肝硬化时，胆盐超载，FXR参与肝细胞毛细胆管膜上MRP2转录的上调；FXR的活化还可诱导BSEP、MRP2表达，促进胆汁酸及DBIL分泌，调节胆汁成分；此外，在快速循环转运过程中，BSEP可能通过降解磷酸化、糖基化、泛酸化等蛋白质修饰作用而保护自己，以避免被降解。同时因FXR的下调致BSEP、MRP2表达减少，肝脏分泌DBIL入胆汁的能力受损，使DBIL升高，血清生化检测可观察到TBIL、DBIL、TBA等异常[19]。国外学者Chen WD1等[20]的研究证实，FXR在胆酸激活下，通过与FXR形成异二聚体，继而与BSEP及MRP2启动子区的IR-1结合来调节基因转录。而本研究结果显示，肝硬化合并胆囊结石患者FXR与BSEP、MRP2存在正相关性，进一步论证了FXR、BSEP及MRP2在胆汁酸代谢异常中的相互作用关系。