辛伐他汀对大鼠缺血随意皮瓣作用时NOS和ICAM-1表达的影响*

2018-11-26刘鸿雁彭海涛蒋婷黄文炼何清莲

西部医学 2018年11期

刘鸿雁彭海涛蒋婷黄文炼何清莲

(川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院烧伤整形美容外科，四川南充 637000)

在整形外科中，随意皮瓣的设计遵循长宽比例小于2∶1的原则，头面部可达到3～4∶1[1]。在皮瓣制备过程中，常伴有不同程度的氧化应激损伤及各种炎性反应，影响皮瓣血管生成，引起部分细胞坏死，降低皮瓣成活率[2]，而缺血再灌注损伤是致其坏死的重要原因之一[3]。采用超比例皮瓣时，常需进行“延迟”二期手术，以改建皮瓣血供达到修复目的。辛伐他汀作为传统的降血脂药物，被广泛应用于高脂血症的临床治疗。已有大量研究证明，他汀类药物存在非依赖HMG-COA 还原酶的作用机制，包括诱导凋亡、抑制增殖及对炎症、内皮功能和血管新生的调节作用等[4-5], 为相关疾病的治疗提供了有效途径。此外，一项实验证实，他汀类药物治疗可以显著改善撕裂皮瓣的血液灌注，减少坏死面积，提高了皮瓣的成活率[6]。根据此特性，笔者认为他汀类药物在未来的整形外科手术中前景广阔。本研究通过对大鼠腹腔注射辛伐他汀，探讨其对大鼠缺血随意皮瓣作用时NOS和ICAM-1表达的影响，以揭示他汀类药物影响随意皮瓣成活的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器选取健康清洁级雄性SD大鼠48只，6周龄，体重(200±20)g，未出现特定病原菌级(SPF级)，购自川北医学院动物实验中心。辛伐他汀原粉(批号：sb196-25mg050M4708， Sigma公司，美国)，使用前溶解配成1mg/ml的溶液；大鼠细胞间粘附因子-1(ICAM-1)ELISA 检测试剂盒、大鼠一氧化氮合成酶 (NOS) ELISA 检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；TS100光学显微镜(OLYMPUS,日本)；图像采集系统；-80℃超低温冰箱(新飞，中国)；TGL-16型高速电动离心机(江苏金坛国胜实验仪器厂)；UV-1601 PC紫外/ 可见光分光光度仪。

1.2 实验分组及方法 48只大鼠随机分为实验组及对照组,每组24只。10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉起效后，参照文献[7]方法，将大鼠固定于俯卧位，设计蒂部位于尾端、双侧髂嵴连线的8cm×2cm矩形随意皮瓣，纵轴平行于大鼠长轴，左右对称。沿设计线切开皮肤、皮下组织，掀起至肉膜深面，彻底止血，确保皮瓣的随意性，4-0丝线将皮瓣原位缝合,伤口涂抹红霉素眼膏。手术过程均由同一人在严格无菌条件下完成。于术后30min及术后1～7d相同时间点另一人通过腹腔注射给予实验组辛伐他汀5mg/kg，对照组于同时间点同法给予相同体积生理盐水。术后7d取材观察。

1.3 检测指标

1.3.1 大体形态观察观察大鼠是否存活，皮瓣的色泽、弹性、坏死范围等情况。术后第7d，两组分别随机抽取大鼠8只，拍摄整个皮瓣情况，Image-Plus 6.0图像分析系统测定皮瓣成活面积及总面积，按公式计算皮瓣成活率。成活率=成活面积/总面积×100%，每只大鼠测量2次，取平均值。

1.3.2 组织学观察取皮瓣中轴线大小为8cm ×1cm全厚皮瓣组织，甲醛固定、石蜡包埋，4μm厚切片并进行HE染色。镜下观察近、中、远段(距离蒂部2、4、6 cm 部位)各皮瓣组织结构层次、炎性浸润程度、毛细血管增生及肉芽组织生长等情况。

1.3.3 NOS和ICAM-1含量测定测定成活率后，断颈法处死大鼠，取皮瓣中轴距蒂部4cm处全厚皮瓣，大小为0.5cm×0.5cm，称重后电动匀浆机制成10%匀浆液，取上清液离心，按说明书检测皮瓣中NOS、ICAM-1含量。

2 结果

2.1 大体观察两组大鼠无意外死亡，均存活至实验完成，皮瓣无积血、积液及感染。术后2～3d，两组皮瓣远端出现不同程度的紫红或暗红区域，界限不清；术后4～5d，两组皮瓣的远端出现大小不等、进行性扩大的颜色加深带；6～7d，远端黑色坏死范围趋于稳定，成活皮瓣远端均有不同程度皱缩，与对照组相比，实验组变黑坏死区域较小。术后第7d，实验组皮瓣平均成活率[(63.44±4.30)%]高于对照组[(46.87±6.02)%]，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 组织学观察两组皮瓣的远段均呈现全层坏死，为焦痂样改变，组织结构崩解，皮下组织明显水肿，大量炎性细胞浸润。对照组：皮瓣近段表皮完整，皮下轻度水肿，轻度炎性浸润，皮下纤维有增生；中段各层组织结构层次不清，表皮明显萎缩、变薄，皮下组织水肿明显，大量炎性细胞浸润，皮下纤维无明显增生,见图1。实验组：皮瓣近段表皮完整，无萎缩，轻度角化过度，真皮和皮下组织无明显炎性浸润，组织无水肿，皮下纤维增生明显；中段表皮萎缩不明显，皮下组织轻度水肿，炎性细胞浸润较轻，皮下纤维组织有增生，并见较多新生血管形成，见图2。

图1 对照组中段组织学观察

Figure1Histologicalobservationinthemiddlepartofthecontrolgroup

图2 实验组中段组织学观察Figure 2 the experimental group

2.3 NOS和ICAM-1含量测定

2.3.1 NOS活性比较实验组皮瓣近、中、远各段在术后7d NOS活性值均大于对照组同段，组间差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组皮瓣NOS活性比较Table 1 The NOS in skin flap of the two groups

2.3.2 ICAM-1含量比较实验组皮瓣近、中、远各段ICAM-1值在术后7d均小于对照组同段，组间差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组皮瓣ICAM-1含量比较Table2 The ICAM-1 in skin flap of the two groups

3 讨论

超长宽比例随意皮瓣具有随意、灵活、使用方便等特点，已被广泛应用于整形外科手术中。但是当长宽比例大于2：1 时，皮瓣远端容易发生严重的缺血坏死，致手术失败[8]。因此，减少随意皮瓣远端坏死有利于提高皮瓣成活率，降低二次手术风险，减少围手术期并发症。本研究采用改良Mcfarlane皮瓣，皮瓣长宽比例为4∶1，该模型设计蒂部位于尾端，比位于头端更加稳定[9]，啃食率低，便于观察，适用于皮瓣成活的干预研究[10]。本研究结果显示，两组皮瓣的远段均发生了不同程度的坏死，但实验组皮瓣成活率较对照组高，提示缺血随意皮瓣造模成功。

辛伐他汀作为临床中常用的他汀类调脂药物之一，被广泛应用于调脂治疗及冠心病一二级预防，并且疗效显著[11]。越来越多的证据表明，他汀类药物发挥着降脂以外的作用，能够抑制炎性因子的表达，降低血清炎症标志物，对炎性反应过程各阶段有着明显的抑制作用，可非胆固醇依赖性地上调NOS的表达和NO的合成，达到抑制炎症反应、血小板聚集和血管平滑肌增殖的效应[12-13]。已有研究发现，通过对心肌梗塞的动物模型应用辛伐他汀可明显减小梗死面积，发挥对缺血心肌的保护作用，但其对皮瓣成活是否具有影响及其可能的机制国内鲜有报道。

实验证实，氧自由基的大量产生是皮瓣缺血再灌注损伤的重要发病环节。组织的缺血性损伤还可以使激活的白细胞释放活性氧簇(ROS)。ROS可以与细胞膜脂质、蛋白质以及 DNA 等发生反应，破坏细胞结构，从而损伤神经元[14]。此外，缺血性损伤还可以激活胶质细胞、内皮细胞膜表面的TLR2信号通路，使 NF-κB 的活性上调，促进环氧化酶-2(COX-2) 、IL-17、IL-23、IL-1β、TNF-α 的表达，而促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK) 信号转导通路的激活则进一步促进 IL-6、IL-8、TNF-α等炎症介质的合成，加重局部的炎性反应，并引起严重的氧化应激，导致细胞死亡[15-17]。皮瓣坏死早期，局部组织的缺血性损伤首先表现为中性粒细胞的浸润与激活，随后激活的胶质细胞、巨噬细胞以及血管内皮细胞释放ROS 、基质金属蛋白酶 (MMPs) 、诱导性一氧化氮合酶(iNOS) 、TNF-α、IL-1β、细胞间黏附分子( ICAM) 、血管黏附分子( VCAM) 等物质，使氧自由基和有害蛋白酶类发挥破坏作用，远段皮瓣容易发生坏死。

近年的研究表明，烟酰胺二核苷酸磷酸盐 ( NADPH) 氧化酶催化 O2转变为ROS，是血管及神经系统超氧化物的主要来源[18]。NADPH 氧化酶( NOX) 有 5 种亚型，他汀类药物通过抑制Rac蛋白活性，使下游 NOX1 和 NOX2 活性减弱，减轻由于 NOX 活化导致的细胞损伤。辛伐他汀可以通过抑制 NOX2 蛋白的表达，降低ROS水平，纠正营养障碍模型小鼠的氧化应激、慢性炎症以及纤维化进程[19]。

此外，他汀类药物可以通过抗炎症、抗氧化应激、抗血小板聚集等多种途径实现对血管内皮屏障的保护，而这些作用被认为可能与其上调内皮型一氧化氮合酶(iNOS) 的活性，增加一氧化氮(NO) 的合成和生物利用度有关[20]。对ApoE基因缺陷小鼠动脉斑块的研究表明，辛伐他汀可以显著缩小斑块内富含脂质的坏死内核，增加斑块内巨噬细胞、平滑肌细胞的数量，在斑块局部减少 RAGE 的形成，抑制 NF-κB的激活，使ICAM-1、VCAM-1分泌减少[21]，这与本次实验结果NOS生成较对照组增多，ICAM-1含量较对照组减少的结果一致，提示辛伐他汀可能通过增加一氧化氮合酶的合成，降低细胞间粘附分子-1的表达，减少中性粒细胞的趋化、黏附和浸润，减轻白细胞及内皮细胞黏附，从而减轻炎性细胞对内皮细胞及组织的损伤，进而发挥抗炎作用，达到提高皮瓣成活率的目的。