完全氨氧化菌及其硝化作用的研究进展

史国帅 白 莉 周立光

(1:吉林建筑大学 市政与环境工程学院,长春 130118;2:中国科学院生态环境研究中心饮用水科学与技术重点实验室，北京 100085)

0 引言

硝化过程是微生物将氨氧化为硝酸盐的生物学过程,是自然界中氮循环的关键过程,也是许多农业应用的重要方面.自19世纪90年代硝化过程被发现以来,传统的硝化过程一直被认为是由两类不同的化能自养硝化细菌即:氨氧化细菌(Ammonium-oxidizing bacteria,英文缩写为AOB) 和亚硝酸盐氧化细菌(Nitrite-oxidizing bacteria,英文缩写为NOB)完成的[1].到2005年,Könneke等人发现氨氧化古菌(Ammonium-oxidizing archaea,英文缩写为AOA) 在土壤和水生态系统的硝化过程中也发挥着重要作用[2-3].但这仍没有改变学术界的普遍认识即硝化过程由氨氧化过程和亚硝酸盐氧化过程等两步完成.2006年,Costa 等人预测理论上存在可进行完全硝化的微生物,并将其命名为完全氨氧化菌(COMplete AMMonia OXidizers,以下简称Commamox),但当时这种分工的原因仍不清楚[4].直至近几年的一些研究富集到了可将氨完全氧化成硝酸盐的细菌,该细菌在系统进化上属于硝化螺菌属(Nitrospira)谱系II的单一微生物,从而证明了Costa等人提出的假设[5-8].

Commamox的发现,使学术界对硝化过程有了一个全新的认识,同时也引出了如下与硝化作用研究相关的亟待解决的3个重要科学问题.首先,Comammox,AOA和AOB均以氨作为能量代谢底物,在同一生境中,这3类微生物之间的关系如何?其次,尤为重要的是Comammox与传统的硝化过程(AOA,AOB和NOB)的生态位划分的研究,这对硝化作用的理解有更重要的意义；最后,Comammox,AOA和AOB代谢过程中是否释放N2O及其排放量亦需要重新评估.基于此,本文拟对目前Comammox的研究做一回顾,并展望未来的研究方向.

1 概述

传统的硝化过程由两步完成:氨氧化细菌和/或氨氧化古菌(Ammonium-oxidizing microorganisms,英文缩写为AOM).先将氨氧化成亚硝酸盐,然后由亚硝酸盐氧化细菌(NOB)将亚硝酸盐氧化成硝酸盐.其中氨氧化微生物(AOM)和NOB主要是化能自养菌,氨和亚硝酸盐分别是氨氧化微生物和亚硝酸盐氧化细菌进行自养生长的唯一能源,不需要任何有机化合物,仅利用所产生的化学能就可以维持生存.最近研究发现的3 种经过富集细菌(Candidatus nitrospira nitrosa，candidatus nitrospira nitrificans和candidatus nitrospira inopinata)和一种未经过纯培养的细菌(类Nitrospira)[5-7],均具备单独将氨氧化为硝酸盐的能力,这些微生物被定义为完全氨氧化菌(Comammox).目前的研究认为,Comammox均属于硝化螺菌属(Nitrospira spp).硝化螺菌属(Nitrospira)至少存在6种系统发育亚系[9],其中谱系II在自然和工程生态系统中分布最广泛,已发现的Comammox细菌均属于硝化螺菌属谱系Ⅱ[5-7].此外,与传统的硝化微生物相比,Comammox生长速度更加缓慢,但是产生的能量更多[4].

2 Comammox分布

Comammox自发现以来,便受到了广泛关注,研究主要集中在不同生态系统中的生态学意义及环境相关性方面.基于富集培养的Comammox物种中氨氧化功能基因(如AmoA，AmoB，AmoC和Hao基因),在许多已发表的数据库中对环境样品进行宏基因组筛选,发现Comammox细菌在一系列陆地和水生生态系统中广泛存在,包括农业土壤、淡水栖息地、污水处理厂(Wastewater Treatment Plants,英文缩写为WWTPs)和饮用水处理等系统中[5-9].Comammox AmoA基因序列与先前指定的属于Crenothrix多孢菌的未培养的甲烷氧化菌的甲烷单加氧酶序列高度相似[5-6].因此，基于PCR的研究可能错误地将Comammox AmoA基因分类为环境样品中的Crenothrix PmoA基因[10].基于以上,这些研究结果提供了强有力的证据,表明Comammox细菌可能具有比以前更广泛的环境分布，并在未来研究中必须将单步硝化纳入这些生态系统中.以下介绍Comammox在一些主要环境中的分布情况.

2.1 饮用水系统中Comammox 分布

丹麦饮用水处理厂的扩增子测序和基于qPCR的研究调查发现,Nitrospira被认为在地下水处理的快速砂滤器中起主导作用(占微生物群落的5-10%),其丰度分别比AOB和AOA高出2个和6个数量级[11-12].鉴于这些Nitrospira都属于亚系Ⅱ,Comammox种群水平基因组(CG24)[8]也具有较高丰度 (所有映射的宏基因组测序读数的30%),单步硝化很可能发生在这些快速砂滤器中[11].这与最近的宏基因组学证据一致:Comammox细菌广泛分布在亚洲和北美的几个饮用水系统中[7,9],以及生物过滤装置中高丰度Nitrospira[13-14].有趣的是,在消毒的饮用水系统中也观察到高丰度亚系II硝化菌[15],这突出表明需要评估Comammox对供水期间不需要硝化作用的贡献.

2.2 工程系统中Comammox 分布

除了饮用水系统外,Bartelme等[16]人的研究表明,在RAS生物滤池中,Comammox是最丰富的氨氧化剂,其丰度是AOA丰度的1.9倍,比AOB的丰度高出3个数量级.此外,在污水处理厂中也发现了Comammox细菌[5,17],与活性污泥中Nitrospira的高丰度和微观多样性相一致[18].虽然它们在污水处理厂中的分布情况很大程度上尚未开发,但来自奥地利维也纳的一家大规模水厂的一项研究报告显示,Comammox细菌占硝化螺菌属种群数量的43-71%,且丰度高于AOB[5].这些研究均表明Comammox在工程生态系统中是进行硝化的重要参与者,与AOA,AOB和严格的亚硝酸盐氧化的Nitrospira的多样化群体相互作用.

2.3 土壤环境中Comammox 分布

AOB,AOA和Comammox细菌可能都会导致土壤中的氨氧化.然而,它们的相对贡献很难估计,因为不同的环境因素会影响它们的丰度和活性[19].最近,基于基因组序列研究发现,Comammox细菌似乎具有广泛的代谢多样性,因此,它可能在多种环境中具有竞争力[20].虽然这些观察结果是研究耐盐的Comammox细菌,但也可预测它们与土壤硝化作用的相关性.实际上,在多个(农业)土壤宏基因组中发现了Comammox序列[5-6],并且在稻田土壤中检测到约25%的氨氧化剂[21].此外,在森林土壤中也检测到Comammox细菌[22],而且pH值为4.0到9.0的森林土壤都显示出Comammox的潜力[22].尽管高AmoA基因拷贝数不一定与氨氧化程度相关,但它仍然突出了Comammox细菌在土壤中的重要作用.

Comammox细菌不仅存在以上环境中,而且在沿海水域[16]、河流沉积物和咸水湖沉积物[21]中也有发现,甚至大气中的细颗粒物质也是Comammox细菌的栖息地[23].无处不在的Comammox细菌表明它们对不同生态系统中的硝化作用都具有潜在的贡献.虽然Comammox在许多环境中被广泛发现,但与其他氮循环微生物的关系的研究报道还很少.

3 Comammox系统发育分析

Comammox 16S rRNA或nxrB基因序列的系统发育分析表明其不形成单系群,而是穿插在严格的亚硝酸盐氧化的硝化螺菌属中[5-7]如图1(a)所示.因此,使用16S rRNA或nxrB基因的系统发育分析无法区分Comammox与传统的Nitrospira.由富集物的宏基因组数据发现,Comammox编码的氨单加氧酶(AMO)在进化上与传统的AOB和AOA的氨单加氧酶(AMO)基因不同[5-6]如图1(b)所示,并且已用于Comammox的分类学研究.

(a)基于16S rRNA的Nitrospira属的系统发育树.Comammox nitrospira用红色表示.Nitrospira亚系用罗马数字表示.(b)氨/甲烷单加氧酶家族的系统发育分析.Comammox nitrospira的AmoA蛋白质簇显示为红色,典型氨氧化剂的AmoA序列显示为绿色.缩写:Amo,氨单加氧酶;Emo,乙烷单加氧酶;Hmo,烃/丁烷单加氧酶;Pmo/Pxm,颗粒甲烷单加氧酶.

基于AmoA基因的系统发育分析认为,Comammox nitrospira谱系Ⅱ,包括两个分支A和B[5-6](Clade A和Clade B).目前已发现的Candidatus nitrospira nitrosa,candidatus nitrospira nitrificans 和Candidatus nitrospira inopinata纯培养菌均属第一个分支(Clade A)[21,24].最近,Pjevac等[21]人针对Comammox的AmoA基因设计了特异性引物,并且这对引物具有广泛的覆盖范围,已用在实时定量PCR方法中,快速、准确地检测环境中Comammox的丰度.

4 Comammox与其他氮循环微生物的关系

4.1 Comammox与典型的硝化微生物

通过宏基因组数据分析，发现Comammox与AOA和AOB同时存在农业土壤,淡水栖息地、污水处理厂(WWTPs)和饮用水处理等系统中[5-9,16],说明它们理论上是可以共存的.然而,鉴于宏基因组学和扩增PCR分析有一定的局限性,需通过其他方法如Comammox特异性引物来确定Comammox细菌的丰度.目前通过定量数据发现,在森林土壤[22]、大气颗粒物[23]、循环水产养殖系统[16]和地下水快速砂滤池[24]中同时存在Comammox,AOA,AOB和NOB，因前3类微生物均利用NH4+作为能源物质，推测Comammox细菌和典型的硝化微生物间存在竞争,但在环境中可以共存.此外,海洋中AOA对氨具有很高的亲和力,Kits等人研究发现,Nitrospira inopinata对氨的亲和力高于陆地中AOA氨的亲和力,AOB对氨的亲和力最低[25],说明在陆地土壤中,氨浓度有限的情况下,Comammox是可以竞争过AOA和AOB的.目前在海洋宏基因组中没有鉴定到Comammox氨单加氧酶A基因,表明Comammox广泛分布于除了海洋以外的其他环境中[5].

虽然Comammox nitrospira inopinata与严格的亚硝酸盐氧化过程中的Nitrospira物种(传统意义上的NOB) 密切相关,但研究发现，它对亚硝酸盐的亲和力很差[20].所以,在亚硝酸盐浓度较低的环境中,可能不利于它作为严格的亚硝酸盐氧化细菌生长.但当环境中适合Comammox nitrospira inopinata生长时,亚硝酸盐可在细胞内累积,从而克服了对亚硝酸盐亲和力差的情况.

4.2 Comammox与Anammox

Van Kessel等[6]人发现,Comammox细菌可在缺氧条件下与厌氧氨氧化(Anammox) 细菌形成紧密的共聚集体,表明这些微生物可能是互生而非竞争关系.推测Comammox在缺氧条件下通过氨氧化为厌氧氨氧化细菌提供底物亚硝酸盐.需进一步通过实验证实这一推测.从而达到在氮的去除过程中可以维持这种相互作用的潜在控制策略.尽管它们对工程和自然生态系统都具有潜在的重要性,但是Comammox,AOA,AOB和NOB之间的生态位分离的因素仍然未知.

5 Comammox生态位

许多研究结果表明，AOA和AOB在土壤中的相对贡献及其生态位受多种环境因素的影响,如:氧[27-28],氨[29-30]和pH[31]等.然而,关于环境因子对Comammox的影响还尚不明确.部分研究发现，Comammox细菌中Nitrospira nitrificans适合低氨的浓度[5].最近的动力学研究还表明,与土壤AOA和AOB相比,Comammox细菌中Nitrospira inopinata具有更高的底物亲和力[20](见图2),以上说明Comammox细菌具有更强的摄取底物能力,可能在低氨浓度下具有竞争优势.此外,基于基因组数据分析,Comammox细菌可能更适应低氧或微量氧环境[5].因此,Comammox可能更适合在低溶解氧浓度下生长,这与Costa等人的发现一致:Comammox细菌具有更高的氧的亲和力[4].

此外,虽然亚硝酸盐不是Comammox的直接底物和产物,但它会影响传统的氨氧化和亚硝酸盐氧化过程,进而间接影响Comammox.以前的研究表明,Comammox细菌广泛存在于Nitrospira谱系Ⅱ中[5-7],在底物条件限制下,Nitrospira谱系Ⅱ对亚硝酸盐和氧气具有高的亲和力,而Nitrospira谱系I具有较低的亚硝酸盐和氧的亲和力,在较高底物浓度下,Nitrospira谱系I才能竞争过Nitrospira谱系Ⅱ[32].因此,这些结果表明，较低的亚硝酸盐浓度可能对Comammox是有益的.综上所述,Comammox具有广泛的生态位.

图2 氨氧化微生物对底物亲和力[25]Fig.2 Substrate affinities for ammonia-oxidizing microbes[25]

在硝化过程中,氨通过亚硝酸盐氧化成硝酸盐.硝化过程的第一步由氨氧化古菌(AOA)和细菌(AOB)使用氨单加氧酶(Amo)酶(未显示)催化.相反,Nitrospira inopinata细菌催化氨完全氧化成硝酸盐.海洋中AOA对氨具有很高的亲和力.Kits等人研究发现,Nitrospira inopinata对氨的亲和力高于陆地中AOA氨的亲和力.AOB对氨的亲和力最低.Nitrospira inopinata被认为是通过水平基因转移过程即从β蛋白原AOB(β-AOB) 中获得了高亲和力的Amo基因,或将其转移到β-AOB获得了高亲和力的Amo基因.之后该物种可能进化出不同程度的氨的亲和力.

6 展望

6.1 硝化作用的研究方向

自Comammox发现以来,在一些循环水产养殖、饮用水、废水处理厂以及一系列天然淡水和陆地生态等系统中都检测到了大量的Comammox.虽然这些初步研究结果强调了它们对工程过程中硝化作用的潜在贡献,但AmoA基因丰度,甚至以及基因表达并不总是与原位硝化活性相关,正如污水处理厂中的AOA[33].对于今后Comammox细菌的研究应集中在检测Comammox原位活性方面,以更好地确定它们在天然和工程系统中对硝化作用和其他养分循环过程的功能贡献.此外,了解调节Comammox细菌功能的生态生理参数对于创建新的过程控制策略以改进硝化作用的管理至关重要.这不仅包括了解环境参数(如氧气和氨的可用性)如何影响Comammox细菌的行为,还包括Comammox细菌与其它氮循环微生物之间的相互作用.这需要将多组学与生理学和反应器实验相结合,以加深对生态系统内氮循环机制的理解.

6.2 一氧化二氮的研究方向

一氧化二氮(N2O)是一种重要的温室气体,目前是二氧化碳(CO2)和甲烷(CH4)之后全球变暖的第3大因素.自然界中N2O的释放主要由异养反硝化和硝化-反硝化作用引起[34-35].之前有学者研究表明氨氧化细菌(AOB)在氨氧化过程可产生N2O[36-37],近年来,也有报道AOA的几种菌株可产生N2O[38-40],然而,在同一环境中AOA和AOB对于N2O的产生还很少有报道.2018年,Hink等人发现在低氨浓度情况下,氨的去除主要由AOA主导,并且只产生少量N2O,相反,在高氨浓度情况下,氨的去除主要由AOB主导,与AOA主导过程相比,会产生更多的N2O[41].虽然Liu S等[42]人发现，Comammox细菌通过富集培养可产生N2O,但在自然环境中Comammox是否产生N2O仍然未知.因此,未来的研究不仅应关注氨氮损失的影响,还应关注自然生态系统中N2O的释放,这将对全球氨氮施肥管理和N2O预算通量产生重要影响.