HPLC法测定十香止痛丸中5种成分的含量

朱远锋，孙全明，谭艳萍

(安康市食品药品检验检测中心，安康 725000)

十香止痛丸为传统治疗胃病的中药制剂，收载于《中国药典》2015年版一部，由香附(醋炙)、乌药、檀香、延胡索(醋炙)、香橼、蒲黄、沉香、厚朴(姜汁炙)、零陵香、降香、丁香、五灵脂(醋炙)、木香、香排草、砂仁、乳香(醋炙)、高良姜和熟大黄组成，具有疏气解郁、散寒止痛之功效。用于气滞胃寒、两胁胀满、胃脘刺痛和腹部隐痛[1]。该制剂处方中丁香、厚朴和木香含有丁香酚、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯和去氢木香烃内酯成分。目前该制剂标准中无含量测定项目，难以有效控制制剂的质量。文献报道多采用薄层扫描法[2]和HPLC法[3]测定十香止痛丸中厚朴酚与和厚朴酚的含量，很少有报道采用HPLC法同时测定十香止痛丸中丁香酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、厚朴酚与和厚朴酚的含量。笔者参考文献方法[4-18]，建立了HPLC法同时测定十香止痛丸中5种成分含量的方法，该方法准确、重复性好，可作为该制剂的含量测定方法。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-2010AHT高效液相色谱仪，LC-2010AHT紫外检测器，LC Solution Single色谱工作站，AUW220D电子分析天平(日本岛津公司)；TG332A分析天平(湘仪天平仪器厂)；KQ-250D型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 丁香酚对照品(批号110725-201615)、厚朴酚对照品(批号110729-201513)、和厚朴酚对照品(批号110730-201614)、木香烃内酯对照品(批号111524-201509)和去氢木香烃内酯对照品(批号111525-201504)，均购自中国食品药品检定研究院；十香止痛丸(内蒙古大唐药业有限公司，批号：150501，150702，151101)；甲醇、乙腈为色谱纯(德国Sigma公司)；其他试剂均为分析纯；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相：甲醇-乙腈-水(8∶50∶42)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：210 nm；进样体积：10 μL。见图1。

2.2溶液的制备 混合对照品溶液的制备：精密称取丁香酚、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯和去氢木香烃内酯对照品适量，加甲醇溶解并制成含丁香酚、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯和去氢木香烃内酯质量浓度分别为65.62，33.85，19.64，25.27和27.49 μg·mL-1的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取十香止痛丸10丸，剪碎，混匀，取6 g，精密称定，加硅藻土适量，研匀，置于具塞三角瓶中，加乙醚100 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，滤过，用乙醚20 mL分次洗涤药渣及滤器，洗液并入滤液，温水蒸干，残渣用甲醇20 mL分次溶解并移至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

图1HPLC图

A.对照品；B.供试品；C.阴性对照(去木香)；D.阴性对照(去厚朴)；E.阴性对照(去丁香)；1.丁香酚；2.和厚朴酚；3.木香烃内酯；4.去氢木香烃内酯；5.厚朴酚。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substances；B.sample；C.negative control(missingRadixaucklandiae)；D.negative control(missingCortexmagnoliaeOfficinalis)；E.negative control(missingFloscaryophylli)；1.eugenol；2.honokiol；3.costunolide；4.dehydrocostuslactone；5.magnolol.

2.3线性关系考察 分别精密吸取2.2项下制备的混合对照品溶液1，2，5，10，20和50 μL，按照2.1项下色谱条件进样分析，丁香酚、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯和去氢木香烃内酯的回归方程分别为：y1=5.39×106x1-34 535(r1=0.999 95)，y2=9.01×106x2+101 257(r2=0.999 96)，y3=1.10×107x3+15 487(r3=0.999 94)，y4=4.49×106x4+2 206(r4=0.999 97)，y5=3.59×106x5+6 835(r5=0.999 93)。结果表明，丁香酚、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯和去氢木香烃内酯分别在0.066～3.281，0.034～1.692，0.020～0.982，0.025～1.264和0.027～1.374 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4精密度实验 取批号为150501的供试品溶液，连续进样6次，每次10 μL，测得丁香酚、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯和去氢木香烃内酯峰面积的RSD值分别为0.83%，1.02%，0.37%，0.52%和0.54%(n=6)，结果表明，该仪器精密度良好。

2.5稳定性实验 取批号为150501的供试品溶液，分别于0，2，4，6，8和12 h进样10 μL，测定峰面积，结果丁香酚、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯和去氢木香烃内酯的RSD值分别为0.96%，1.39%，0.59%，0.68%和1.13%(n=6)，表明供试品溶液在室温放置12 h内稳定。

2.6重复性实验 取批号为150501的供试品6份，按照2.2项下方法进行制备，依照2.1项下色谱条件进样测定，计算含量，测得丁香酚、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯和去氢木香烃内酯含量的RSD值分别为1.22%，1.35%，0.87%，0.89%和1.11%(n=6)，结果表明，该方法的重复性良好。

2.7加样回收率实验 取批号为150501的供试品6份，每份3 g，加硅藻土适量，研匀，置于具塞三角瓶中，分别精密加入质量浓度为50.21，43.49，52.67，21.73和31.47 μg·mL-1的丁香酚、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯和去氢木香烃内酯混合对照品乙醚溶液7.5，15和22.5 mL，按照2.2项下方法制备，依照2.1项下色谱条件进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1加样回收率测定结果

Tab.1 Determination results of recovery tests

成分序号样品含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%丁香酚10.752 80.376 61.117 996.9598.321.3120.754 30.376 61.118 796.7630.757 40.753 21.497 598.2640.752 10.753 21.501 399.4750.748 91.129 71.861 698.5060.751 01.129 71.880 199.95厚朴酚10.663 80.326 20.991 3100.4099.761.1320.667 40.326 20.997 6101.2330.662 10.652 41.302 198.1040.661 40.652 41.315 4100.2550.659 70.978 51.627 098.8660.663 60.978 51.639 199.69和厚朴酚10.791 90.395 01.187 2100.0899.821.3720.793 50.395 01.195 1101.6730.792 30.790 01.580 199.7240.795 80.790 01.574 398.5450.789 51.185 11.951 498.0460.792 71.185 11.987 8100.84木香烃内酯10.323 50.163 00.483 598.1699.511.0220.326 00.163 00.488 799.8230.321 70.326 00.650 2100.7740.322 40.326 00.643 498.4750.319 50.488 90.809 7100.2760.324 30.488 90.811 299.59去氢木香烃内酯10.468 20.236 00.698 297.4698.841.1520.467 70.236 00.702 799.5830.468 90.472 00.930 797.8440.469 10.472 00.932 698.2050.464 10.708 11.171 599.9060.471 50.708 11.180 1100.07

2.8样品测定 取3个批号的供试品各2份，依照2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，结果见表2。

表2样品测定结果

Tab.2 Results of sample assay

批号丁香酚/mg·g-1厚朴酚/mg·g-1和厚朴酚/mg·g-1木香烃内酯/mg·g-1去氢木香烃内酯/mg·g-11505010.246 30.224 10.261 90.103 50.154 41507020.268 70.236 40.256 20.117 60.160 51511010.283 20.257 50.300 20.159 30.122 3

3 讨论

3.1提取溶剂的选择 本实验分别比较甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿和乙醚作为提取溶剂的差别。结果表明，甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿和乙醚作为提取溶剂样品中5种指标成分峰面积差异不大，考虑到以乙醚提取甲醇溶解可有效除去样品杂质，提高分离度，故选用乙醚提取甲醇溶解。

3.2提取方法和超声时间的选择 本实验分别比较了加热回流提取1 h和超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min的2种前处理条件，结果提取率无显著差异，因回流提取步骤繁琐，操作过程中易造成成分损失，而超声提取方法简便，故选用超声处理条件。同时分别考察了超声提取(功率250 W，频率40 kHz)15，30，45和60 min的提取效果，结果超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min已提取完全，最终选择超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min为最优的前处理条件。

3.3流动相的选择 本实验分别选择甲醇-水、乙腈-水和甲醇-乙腈-水为流动相，考察了样品分离效果，结果采用甲醇-乙腈-水为流动相时可使5种指标成分完全分离，阴性无干扰，且在此流动相条件下指标成分峰形良好，能够满足相应成分的分析要求。

3.4检测波长的选择 取丁香酚、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯和去氢木香烃内酯对照品流动相溶液，用紫外分光光度计在200～380 nm波长范围内进行扫描，图谱显示，丁香酚在209，235和284 nm处有最大吸收，厚朴酚与和厚朴酚在210和294 nm处有最大吸收，木香烃内酯和去氢木香烃内酯在210和225 nm处有最大吸收，故选用210 nm为测定波长。

4 小结

本文对十香止痛丸方中的丁香、厚朴和木香3味中药中5种成分采用HPLC法同时测定含量，能够较全面地控制该制剂质量，且方法简便、准确、重复性好，可为其质量控制提供依据。