基于16S rRNA测序的海南坡鹿肠道菌群结构分析

王 悦苏 力 陈兴永陈 武 田秀华杨锴斌

(1.庆元县林业局，丽水，323800；2.广州动物园，广州，510070；3.东北林业大学，哈尔滨，150040；4.浙江凤阳山-百山祖国家级自然保护区百山祖管理处，丽水，323800)

肠道微生物(Gut microorganism)指的是动物肠道内复杂的、全部的动态变化的微生物群落，肠道微生态系统与宿主的营养、代谢和免疫等方面密切相关[1]。肠道菌群包括益生菌、有害菌、条件致病菌3种[2]，肠道细菌含条件性致病菌，表明胃肠道是病原体入侵的潜在途径[3]。肠道菌群是一个复杂的生态系统，它与许多其他因素的相互作用共同影响宿主的健康和疾病[4]。动物肠道微生物群在出生后开始繁殖，宿主和肠道微生物群共同构成参与宿主免疫和消化系统正确功能的肠微生物群，一旦“宿主—肠道微生物群”系统不平衡，就会出现各种疾病[5]。由于宿主年龄，日粮组成，生活方式和环境以及其他因素都影响宿主肠道微生物群的组成，因此肠道微生物群的组成并不固定[6-8]。研究数据表明，饮食是影响肠道微生物群组成的重要因素[9-10]。

肠道菌群是宿主的一个组成部分。微生物群在宿主适应性中起关键作用，包括肠细胞的增殖，对病原体的防御，次生代谢物的产生和复合碳水化合物的消化[11]。此外，肠道微生物群的存在可以促进肠上皮细胞的分化并抵抗病原微生物的侵袭[12]。草食动物研究表明，肠道微生物群可分解纤维素并代谢降解食物和毒素[13]。对于反刍动物来说尤其如此，因为它们独特的消化特性和微生物有助于适应高纤维含量的食物，同时也使它们易患多种疾病[14]。因此，与大多数其他动物相比，反刍动物的肠道菌群在物种生物学中发挥更突出的作用[15]。

海南坡鹿(Cervuseldiihainanus)是珍贵濒危的热带鹿种，曾广泛分布于海南岛[16]。海南坡鹿是我国国家Ⅰ级保护动物，曾因人类活动等原因濒临灭绝，后通过建立保护区设围栏使其种群恢复并扩大。时至今日，由于保护区内其天敌蟒蛇(Pythonmolurusbivittatus)数量的增加等原因，致使海南坡鹿种群数量一再减少，海南坡鹿种群再度面临危机，目前对于该物种保护问题还有待解决。当前对于海南坡鹿的研究主要集中在行为习性、种群动态、生境选择、食性等领域，而关于海南坡鹿肠道菌群相关的研究还未见报道。考虑到哺乳动物肠道菌群多样性对肠道的稳态与健康的重要性，本研究从海南坡鹿的肠道菌群出发，致力于筛选益生性芽孢杆菌并通过高通量测序技术对海南坡鹿肠道菌群多样性进行研究，探索其肠道菌群结构和多样性以及不同性别间肠道菌群的差异，为将来筛选新的菌种以及在野生动物保护中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

采用非损伤性的粪便取样法，采集广州动物园健康海南坡鹿的新鲜粪便，为减少空气及土壤中的杂菌干扰，只取粪便的中间段并进行微生物DNA的提取及测序分析。粪便样品对应的个体信息如表1。其中，雌性为A组，雄性为B组。

表1 样品信息

Tab.1 Information of samples

1.2 实验方法

使用QIAamp®Stool Mini Kit试剂盒，根据说明书提取海南坡鹿粪便样品的总基因组DNA，对PCR产物进行切胶纯化，采用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收产物，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。采用特异引物(515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)针对样品中16 S rRNA的V4区进行扩增，进行聚合酶链式反应PCR扩增，PCR扩增反应条件94℃预变性5 min，94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃再延伸10 min。利用Illumina平台测序后去除低质量reads。使用FLASH软件进行序列拼接，将双末端测序得到的成对reads用重叠关系组装成一条序列，得到高变区的Tags[17]。去除无重叠部分关系的reads，依靠reads间的重叠部分拼成Tags。

2 结果与分析

海南坡鹿16个样品共得到有效序列677468条，平均每个样品42341条，平均长度为252 bp。拼接的Tags经过优化后，在97%相似度下将其聚类为用于物种分类的OTU(Operational taxonomic units)，统计每个样品在每个OTU中的丰度信息(表2)。图1是展现两组样品共有和特有OTU数目的venn图，其中重叠部分表示A、B两组共有的OTU数目为1275个，A组特有的OTU为199个，B组单独有的OTU个数为40。

表2 样品OTU统计

Tab.2 OTU Statistics

续表2

Tags number：样品中能和OTU代表序列比对上，并且OTU具有注释结果的Tags的总数

图1 OTU venn图Fig.1 OTU venn chart

2.1 海南坡鹿肠道菌群整体结构分析

2.1.1 海南坡鹿肠道菌群在门水平上结构分析

从16个海南坡鹿粪便样品中，根据已确定的OTU分类确定其肠道菌群中的18个菌门(图2)。其中，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)在海南坡鹿的肠道菌群中含量最高，所占比例分别为50.49%和36.52%。其次是变形菌门(Proteobacteria)所占比例为3.137%、螺旋体门(Spirochaetes)的比例为2.891%、疣微菌门(Verrucomicrobia)的比例为2.121%、软壁菌门(Tenericutes)的比例为1.679%、广古菌门(Euryarchaeota)的比例为1.410%、TM7的比例为0.488%、浮霉菌门(Planctomycetes)的比例为0.413%、蓝菌门(Cyanobacteria)的比例为0.215%。海南坡鹿肠道菌群含量最高的10个门中，广古菌门属古菌界，其余鉴定出的菌门均属于细菌界。从图2中可以看出海南坡鹿A、B两组的菌群结构在门的分类水平上差异不大，且主要的微生物为厚壁菌门与拟杆菌门，其余菌门的含量相对较少。这些含量较少的菌门并非存在所有的个体中，其中纤维杆菌门(Fibrobacteres)只在110503FM、110602FM、110604FM、110402M、110403M、110505M个体中检测到；Elusimicrobia在110502FM中所占比例为0；LD1只存在于110401FM、110501FM 110503FM、110602FM、110604FM、110606FM、110403M、110603M、110605M中；互养菌门(Synergistetes)只存在于110501FM、110502FM、110601FM、110403M、110505M个体；WPS-2只在110501FM、110601FM、110604FM三个个体中检测到。

2.1.2 海南坡鹿肠道菌群在属水平上结构分析

对海南坡鹿肠道菌群中丰度最高的10个属进行了统计(图3)，结果表明：丰度最高的属为5-7N15，丰度值为7.181%，丰度排名第二的属是普雷沃菌属(Prevotella)，丰度为3.159%，其次是密螺旋体属(Treponema)，丰度为2.788%、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)丰度为2.545 %，颤螺菌属(Oscillospira)丰度为2.304%、CF231丰度值1.843%、瘤胃球菌属(Ruminococcus)丰度为1.652%、艾克曼菌属(Akkermansia)丰度为1.439%、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)丰度为1.340%、梭菌属(Clostridium)丰度值为1.333%。

2.1.3 物种在属水平上的系统进化树分析

图4是在属水平构建的物种系统进化树，反映了物种的进化关系。统计注释到确定的已分类的属，选取丰度最高的作为代表序列构建而成。在进化树中距离越近，表明物种系统关系越近，图中树枝的不同长度代表了物种进化的差异。注释到的属中，有3个属隶属于古菌界下的广古菌门，分别是甲烷短杆菌属、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、vadinCA11，其余属均属于细菌界。进化树中颜色相同的属表示属于同一菌门，属于细菌界的属分属于12个菌门，其中占比例最高的是厚壁菌门有46个属，32个隶属于梭菌目(Clostridiales)；其次是拟杆菌门12个属，均属于拟杆菌科(Bacteroidaceae)。

2.2 不同性别海南坡鹿肠道菌群物种差异分析

2.2.1 不同性别海南坡鹿肠道菌群在门水平上的差异分析

海南坡鹿A组和B组的肠道菌群的相对丰度在门水平上的差异柱形图如图5，对比两组间在门水平上的差异物种发现A组螺旋体门、疣微菌门略大于B组；B组拟杆菌门和厚壁菌门略大于A组。通过t检验计算出差异显著性，在95%的置信区间内，统计差异显著(P<0.05)的门只有一个绿弯菌门(Chloroflexi)(表3)。

表3 T-test组间门水平上差异统计

Tab.3 Statistics species differences at phylumlevel between groups based on T-test

2.2.2 不同性别海南坡鹿肠道菌群在属水平上的差异分析

图6为海南坡鹿A组和B组的肠道菌群的相对丰度在属水平上的差异柱形图，从柱形图可以看出A、B两组在5-7N15属、密螺旋体属和艾克曼菌属显示出较大差异。通过t检验，统计出差异显著(P<0.05)的属共17个(表4)，在A组中丰度较高的属有：脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、瘤胃杆菌属(Ruminobacter)、梭菌属、p-75-a5、草酸杆菌属(Oxalobacter)、02d06、埃希氏菌属(Escherichia)、YRC22、BF311、SHD-231、毛螺菌属(Lachnospira)；在B组中丰度较高的属有：5-7N15、Butyricicoccus、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、Anaeroplasma、Dorea、Blautia。

表4 T-test组间属水平上差异统计

Tab.4 Statistics species differences at generalevel between groups based on T-test

图2 门水平上的物种相对丰度Fig.2 The relative abundance of species on the phylum level

图3 属水平上的物种相对丰度Fig.3 The relative abundance of species on the genes level

图4 物种系统进化树Fig.4 Genus species phylogeny tree

图5 不同性别海南坡鹿在门水平上的物种相对丰度Fig.5 The relative abundance of different sex species on the phylum level

图6 不同性别海南坡鹿在属水平上的物种相对丰度Fig.6 The relative abundance of different sex species on the genera level

图7 LDA值分布柱状图和进化分支图Fig.7 Distribution histogram and evolutionary branch graph based on LDA value

2.2.3 基于LefSe(LDA Effect Size)分析海南坡鹿雌雄组间物种差异

用LefSe确定海南坡鹿雌雄组间具有显著差异的物种(图7)，LDA评分直方图显示各组间具有统计学差异的生物标志(Biomarker)，柱形图的长度代表LDA评分。该图显示了A组(红色)和B组(绿色)之间具有显著差异的微生物类群(LDA Score> 2)。在A组中具有丰度差异的有：脱硫弧菌属、SHD_231、Streptophyta、Chloroflexi、厌氧绳菌科(Anaerolinaceae)、厌氧绳菌目(Anaerolineales)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、Succiniclasticum、肠球菌属(Enterococcus)、肠球菌科(Enterococcaceae)、埃希大肠杆菌(Escherichiacoli)、埃希氏菌属、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、瘤胃杆菌属、Chloroplast、p_75_a5、Adlercreutzia、毛螺菌属、BF311、Christensenellaceae、F16、CW040、TM7_3、TM7、密螺旋体属、螺旋体科(Spirochaetaceae)、螺旋体目(Spirochaetales)、螺旋体门；在B组中具有丰度差异的有：5_7N15、拟杆菌科、理研菌科(Rikenellaceae)、p_2534_18B5、Barnesiellaceae、Coprobacillus、考拉杆菌属、Ruminococcus_callidus、Clostridium_hungatei、Blautia、Butyricicoccus_pullicaecorum、Butyricicoccus、Epulopiscium、Anaeroplasma。

进化分支图显示A组和B组之间在5个层次上分类群相对丰度差异的分类图。由内至外辐射的圆圈代表了由门至属(或种)的分类级别，每个不同分类的小圆圈代表一个分类单元，圆的直径与相对丰度成正比。红色和绿色圆圈表示A组和B组显示相对丰度的差异，黄色圆圈表示无显著差异的物种，进化分支图与LDA值分布柱状图的结果是一致的。

3 讨论

动物粪便中存在的微生物反映了肠道微生物群落的总体组成[18]。本实验中粪便取样是非损伤性的，因此可减少对濒危或隐蔽物种造成的伤害或影响。本研究采用16S rRNA高通量测序来分析海南坡鹿肠道菌群结构，粪便DNA的高通量测序可以很好地解释细菌群落，因为它能有效地处理混合DNA模板，一些近期的研究也采用这项技术来探索不同物种的微生物，如人类[19]、梅花鹿(Cervusnippon)[20]、林麝(Moschusberezovskii)[21]、牛[22]、川金丝猴(Rhinopithecusroxellana)[23]等。肠道微生态系统是一个不断发展的系统，其物种多样性和丰富度对于维持宿主的正常生理状态具有重要的功能作用。然而，肠道微生物群也受到宿主的影响[24]。根据研究的数据显示，食性是影响哺乳动物肠道微生物群的主要因素[25-26]。在本次研究中，海南坡鹿的饲料主要由象草、燕麦草、黄豆、番薯、颗粒料、苹果和胡萝卜组成。

通过对雌性、雄性海南坡鹿肠道菌群的比较发现，不同性别海南坡鹿的肠道菌群多样性无明显差异，但肠道菌群结构有显著差异。对海南坡鹿肠道菌群结构及多样性分析发现，海南坡鹿粪便菌群分属于18个菌门，其中核心菌门是厚壁菌门和拟杆菌门，这与其他学者在反刍动物中的观察结果一致[27-30]，而在一些关于肉食性动物如豺(Cuonalpinus)的研究中，厚壁菌门并不总是最主要的菌门，也可能排在拟杆菌门之后[31]。这些菌门主宰着许多陆生脊椎动物的细菌群落，表明这个群体在肠道内具有生态和功能重要性[32-33]。厚壁菌是主要的纤维素分解细菌，并将纤维降解为挥发性脂肪酸以供宿主利用，拟杆菌的主要功能是帮助宿主降解碳水化合物(尤其是多糖)、蛋白质和其他物质，以提高宿主的营养利用率，维持肠道微生物生态平衡，还可促进免疫系统发育以增强宿主免疫[34-36]。拟杆菌也是机会性病原体，当正常的微生物生态平衡被破坏时，这些细菌会引起内源性感染[21]。有研究结果显示，胃肠道疾病动物和健康个体的肠道微生物群存在显著差异：一些拟杆菌菌种增加，而乳酸菌种减少[37]。乳酸菌的作用是可以抑制多种病原菌，如沙门氏菌、肺炎球菌、致病性肠杆菌和葡萄球菌等。因此圈养海南坡鹿的肠胃疾病高发可能是由这种情况引起的。变形菌门是继厚壁菌门和拟杆菌门之后丰度最高的门，是大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)中最主要的菌门，它可以帮助其降解主要食物中的木质素[38]，变形菌门还能够分解牛动物饲料的各种组分[39]，因此变形菌门的相对丰度较高可能是由于人工饲喂的颗粒料等。

普雷沃菌属是海南坡鹿肠道菌群的核心菌属，可能与纤维生物量或单宁的降解有关，普雷沃菌属于氢消耗菌，可通过二羧酸途径或丙烯酸途径产生丙酸，反过来可能导致甲烷产量下降，因为二羧酸或丙烯酸途径可以与甲烷菌竞争氢气[40]。琥珀酸弧菌属可以利用糖分解产生的有机酸，使前胃中产生的有机酸不会积聚。