超高效液相色谱-串联质谱法同时检测柑橘样品中氟吡呋喃酮及其代谢物残留

李双双，欧晓明,*，金晨钟*，晏 姣，张贵群，梁 骥，梁贵平

(1.湖南人文科技学院 农药无害化应用重点实验室/湖南省农田杂草防控技术与应用协同创新中心，湖南 娄底 417000；2.湖南化工研究院 国家农药创制工程技术研究中心，湖南 长沙 410014；3.湖南加法检测有限公司，湖南 长沙 410014)

氟吡呋喃酮(Flupyradifurone)，商品名为Sivanto或Sivanto Prime，化学名为4-[(6-氯-3-吡啶基甲基)(2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮，是德国拜耳公司开发的一种新型丁烯酸内酯类杀虫剂，可作用于靶标害虫的中枢神经系统，为昆虫烟碱乙酰胆碱受体激动剂，主要登记用于防治蔬菜、果树、棉花、大豆等作物的蚜虫、粉虱、木虱、叶蝉等害虫，表现出明显的内吸、触杀、胃毒、渗透和选择作用，且对蜜蜂安全[1-2]，其代谢物为二氟乙酸(DFA)、二氟乙氨基呋喃酮(DFEAF)和6-氯烟酸(6-CNA)。目前针对氟吡呋喃酮的研究主要集中于合成和应用方面，如杨吉春[3]、曹庆亮[4]、赵国建[5]等研究了氟吡呋喃酮的合成，陈敏[6]、胡菡青[7]等进行了氟吡呋喃酮对番茄烟粉虱和柑橘木虱的田间药效试验，武鹏等[8]报道了氟吡呋喃酮的原药分析方法，而有关氟吡呋喃酮及其代谢物在柑橘上的残留分析方法及其在环境中的归趋研究尚未见报道[9-12]。基于此，本文采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱技术(UPLC-MS/MS)建立了同时检测柑橘样品中氟吡呋喃酮及其代谢物残留的方法，以期为该药剂在柑橘生态系统中的合理安全用药及其环境安全评价提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1290-646型超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪(美国安捷伦公司)，AL204型电子天平(瑞士梅特勒·托利多仪器有限公司)，Scout SE型百分之一电子天平(奥豪斯公司)，HY-B1 型回旋振荡器(金坛市医疗仪器厂)，Vortex-5型涡旋混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，Zonkia SC-3614型低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。

乙腈(质谱纯，Honeywell公司)，甲酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，氯化钠(分析纯，西陇化工公司)，PSA填料(北京安捷飞科技有限公司)；标准品：氟吡呋喃酮(纯度99.4%)、二氟乙酸(DFA，纯度95.5%)、二氟乙氨基呋喃酮(DFEAF，纯度99.3%)、6-氯烟酸(6-CNA，纯度98.9%)均由湖南化工研究院国家农药创制工程技术研究中心提供。实验用水为超纯水(自制)。

1.2 样品分析方法

1.2.1提取与净化准确称取适量柑橘样品(柑橘皮10 g、柑橘全果20 g)于150 mL具塞锥形瓶中，加入40 mL乙腈，回旋振荡1 h，静置取上清液2 mL，加200 mg PSA，涡旋20 s，离心5 min，取上清液过0.22 μm有机相滤膜至进样瓶中，待测。

称取柑橘橘肉20 g于150 mL具塞锥形瓶中，加入40 mL乙腈，回旋振荡1 h，提取液转移至100 mL具塞量筒中，加入5 g NaCl，剧烈摇动，静置10 min，上清液过0.22 μm有机相滤膜至进样瓶中，待测。

1.2.2分析条件色谱条件：Thermo Hypercarb色谱柱(100 mm×3 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液(70∶30，体积比)，等度洗脱，流速0.4 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL。

质谱条件：多反应监测模式(MRM)，正负离子扫描(ESI)，离子喷雾电压3 500 V，雾化气压力103.4 kPa，干燥气温度350 ℃，干燥气流速7 L/min。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的确定

取1 mg/L的氟吡呋喃酮及代谢物混合标准溶液，用针泵进样的方式，首先进行全扫描(Q1scan)，确定各成分的母离子，其次通过MS2SIM确定锥孔电压(DP)，再用Product Ion功能找出子离子并确定碰撞能量(CE)，最后用MRM 扫描的方式优化各质谱参数。

氟吡呋喃酮及其3个代谢产物均含氨基或羰基，易形成稳定的[M+H]+的准分子离子，配制 1 mg/L 的标准溶液，使用两通连接液相色谱与质谱，在正离子模式下全扫描得到氟吡呋喃酮母离子(m/z288.8)和DFEAF母离子(m/z164.0)；在负离子模式下全扫描得到6-CNA母离子(m/z156.0)和DFA母离子(m/z95.1)。将分子离子作为母离子，给予一定的碰撞能量和碰撞气体，全扫描二级离子，选取丰度较强、干扰较小的 2 个子离子分别作为定性及定量离子(见表1)。

2.2 碎裂电压与碰撞能量的优化

以氟吡呋喃酮为例对碎裂电压进行优化。将氟吡呋喃酮配成1 mg/L的标准溶液，以10 μL进样。初步考察了碎裂电压为200、150、100、50、20 V时的响应值，结果显示150～200 V之间的响应值较高；再考察了碎裂电压为200、180、160、140、120 V时的响应值，结果显示160 V出现最大响应值；最后将电压设定为175、170、165、160、155、150 V，结果显示电压为165 V时响应值最大。实验选择氟吡呋喃酮、DFEAF、6-CNA、DFA的最优碎裂电压分别为165、100、50、35 V。

在最优电压条件下，以氟吡呋喃酮为例对碰撞能量进行优化。将氟吡呋喃酮配成1 mg/L的标准溶液，进样10 μL。先将碰撞能量设置为50、40、30、20、10、5 V，结果显示子离子m/z288.8/125.8在20 V时出现最大响应值，m/z288.8/89.9在30 V时出现最大响应值；再细分各子离子的碰撞能量，发现子离子m/z288.8/125.8在22 V时出现最大响应值，m/z288.8/89.9在34 V时出现最大响应值。氟吡呋喃酮及其代谢物优化后的碎裂电压和碰撞能量等质谱参数见表1。

表1 氟吡呋喃酮及其代谢物的质谱检测参数Table 1 MS/MS conditions of flupyradifurone and its metabolites

2.3 流动相的优化

实验对比了甲醇-水和乙腈-水作为流动相时的质谱响应，发现乙腈-水为流动相时氟吡呋喃酮及其3个代谢产物的质谱响应更好，因此采用乙腈作为流动相中的有机相。另外，考察了在水相中分别添加 0.1%甲酸、1.0 mol/L 乙酸铵和 0.1%甲酸- 1.0 mol/L 乙酸铵对色谱分离及灵敏度的影响，结果显示3 种添加剂对目标分析物的色谱峰形及分离的影响差别不大，但添加少量甲酸后，各化合物的离子化效率更高，灵敏度更好，且添加甲酸的效果好于添加乙酸铵。基于此，本实验最终采用乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相。

2.4 吸附剂的优化

分别考察了不同质量的PSA对净化效果和回收率的影响，结果发现 PSA用量为50、100、200、400 mg时，氟吡呋喃酮及其代谢物的回收率分别为52%～69%、67%～86%、89%～100%、70%～84%。本实验最终选用200 mg PSA作为吸附剂。

2.5 基质效应的考察

基质效应(Matrix effects，ME)是指基质中的共提取干扰物质影响目标化合物的离子化，从而使目标化合物在仪器上的响应发生增强或抑制的现象[13]。因此在进行农残测定时，对目标化合物在不同基质中的基质效应进行评价尤为重要。本文采用较为常用的相对响应值法评价基质效应：ME=(B/A-1)×100%，其中A 为纯溶剂中化合物的响应值，B 为柑橘基质中添加相同浓度农药的响应值[14]。实验考察了0.05、0.1、0.5 mg/L 3个加标水平下4种化合物在全果、果肉、果皮3种柑橘基质中的基质效应。结果表明，在上述3个水平下的基质效应分别为-16.65%～9.68%、18.76%～8.29%和-15.91%～10.59%，基质效应均小于20%，属于弱基效应，对结果影响较小。

2.6 线性关系与定量下限

将500 mg/L的氟吡呋喃酮及其代谢物混合标准溶液用乙腈稀释配成1、5、10、50、100、500 μg/L的系列混合标准工作溶液，按“1.2.2”的色谱条件进行测定。以监测离子峰面积(y) 对相应质量浓度(x，μg/L) 作标准曲线，得到氟吡呋喃酮及其代谢物的线性方程。结果表明，在1～500 μg/L范围内，氟吡呋喃酮及其代谢物的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，相关系数(r2)为0.997 9～0.999 6。

定量下限(LOQ)采用加标回收率进行验证，以符合一定的准确度和精密度要求的最低加标浓度确定为定量下限。经验证，该方法的检出限(LOD，S/N=3)为0.001 mg/L，氟吡呋喃酮及其代谢物在柑橘全果、橘肉中的LOQ为0.05 mg/kg，橘皮中的LOQ为0.1 mg/kg。与其他方法[9-11]相比，本方法的分析时间更短，检出限低于或接近已有方法，灵敏度较高。

2.7 加标回收率与相对标准偏差

采用基质匹配标准溶液外标法定量，在空白柑橘基质中对氟吡呋喃酮及其代谢物进行3个浓度水平的加标回收实验，每个水平处理5个重复，按“1.2.2”的方法进行测定，计算回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表2。由表2可见，氟吡呋喃酮及其代谢物在柑橘全果、果肉中的回收率为71.9%～106%，RSD为0.8%～9.1%；柑橘果皮中的回收率为77.9%～100%，RSD为1.2%～6.5%，说明该方法的精密度和准确度均符合农药残留分析的基本要求[15]。

表2 氟吡呋喃酮及其代谢物在柑橘样品中添加回收率Table 2 The recovery of flupyradifurone and its metabolites in citrus samples

2.8 实际样品的分析

根据《农药残留试验准则》[15]和《农药登记残留田间试验标准操作规程》[16]进行了17%氟吡呋喃酮溶液在柑橘作物上的最终残留田间试验，有效成分用量分别为低剂量制剂2 000倍液(有效成分100 mg/kg)和高剂量制剂1 333倍液(有效成分150 mg/kg)，各设3次施药和4次施药两个处理，另设清水空白对照，处理间设保护带，施药间隔期为10 d，每个处理重复3次，末次施药后间隔14、21、28 d采集柑橘样品，按照“1.2.2”方法测定氟吡呋喃酮及其代谢物在柑橘中的最终残留量，结果见表3。由表3可见，氟吡呋喃酮相较于其代谢产物的检出率更高，且以在柑橘果皮中的检出浓度较高。

表3 氟吡呋喃酮及其代谢物在实际柑橘样品中的残留量Table 3 Detection data of flupyradifurone and its metabolites in citrus field samples

(续表3)

CompoundEffective dose(mg/kg)Times of applicationResidual quantity(mg/kg)Citrus fruitCitrus pulpCitrus peel4<0.05<0.05<0.11503<0.05<0.05<0.14<0.05<0.05<0.1DFA1003<0.05<0.05<0.14<0.05<0.05<0.11503<0.05^0.051 8<0.05<0.1^0.1224<0.05<0.05<0.1^0.116

3 结 论

本文采用UPLC-MS/MS技术建立了同时检测柑橘全果、果肉、果皮中氟吡呋喃酮及其代谢物残留量的定性定量分析方法。样品以乙腈提取，经分散固相萃取净化，直接上机分析，较常用的液相色谱法缩短了样品前处理的时间。该方法选择性强、重现性好、灵敏度高，且前处理简单，溶剂用量少，适用于柑橘样品中氟吡呋喃酮及其代谢物的快速检测，并成功应用于实际样品的测定。