高效液相色谱-串联质谱法测定黄瓜与土壤中烯酰吗啉和氰霜唑及其代谢物的残留量

赵民娟，郭虹娜，邵 华*，金 芬，金茂俊，佘永新，王珊珊，郑鹭飞，王 静

(1.中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量安全重点实验室，农业部农产品质量标准研究中心，北京 100081；2.南京农业大学 食品科技学院 ，江苏 南京 210095)

烯酰吗啉(Dimethomorph)，化学名称为(E,Z)-4-[3-(4-氯苯基)3-(3,4-二甲氧基苯基)丙烯酰]吗啉，有E体和Z体两种异构体，属于羧酸酰胺类真菌杀菌剂，对卵菌纲真菌具有专一性。该化合物通过破坏靶目标生物细胞壁膜的形成，引起孢子囊壁分解，进而导致病菌死亡。目前已登记在菠菜、观赏牡丹、花椰菜、黄瓜等13个作物上，主要用于防治晚疫病、疫病、霜霉病、黑胫病、早疫病等[1-5]。氰霜唑(Cyazofamid)，化学名称为4-氯-2-氰基-5-对甲基苯基-咪唑-1-N，N-二甲基磺酰胺，是日本石原株式会社研制，与BASF公司共同开发的一种磺胺咪唑类杀菌剂，为超级保护性杀菌剂，可通过作用于线粒体电子传递络合物ⅢQi部位来抑制线粒体呼吸作用，同时能阻碍孢子萌发至孢囊形成的各个阶段，从而达到抑制病菌生长的目的。氰霜唑已登记在番茄、观赏菊花、黄瓜、荔枝树、马铃薯、葡萄、西瓜7个作物上，主要用于防治霜疫霉病、疫病、晚疫病、霜霉病等[6-12]。氰霜唑在使用后会迅速分解，4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-腈(CCIM)是氰霜唑在植物体内的主要降解产物，比氰霜唑的毒性高，两者在农产品中的残留可能会给人类健康带来潜在风险[13-14]。因此，我国规定黄瓜中烯酰吗啉的最大残留限量(MRL)值为5 mg/kg，黄瓜中氰霜唑和代谢物CCIM之和的MRL值为0.5 mg/kg[15]；日本肯定列表规定黄瓜中烯酰吗啉和氰霜唑的MRL值均为0.7 mg/kg[16-17]；欧盟规定黄瓜中烯酰吗啉的MRL值为0.5 mg/kg[18]，氰霜唑的MRL值为0.2 mg/kg[19]，且烯酰吗啉的残留定义为“同分异构体之和”，氰霜唑的残留定义为“氰霜唑及其代谢物CCIM之和”。

目前，烯酰吗啉的测定方法主要有气相色谱法[20]、气相色谱-串联质谱法[21]、液相色谱法[22]及液相色谱-串联质谱法[23]等，其中气相色谱法多采用氮吹以及旋转蒸发等方式，耗时较长，灵敏度相对较低。王晓环等[24]建立了高效液相色谱-串联质谱测定烟草和土壤中烯酰吗啉残留量的方法。而氰霜唑的检测方法主要有高效液相色谱法[25-26]和液相色谱-质谱法[27]等。氰霜唑及其代谢产物CCIM的检测方法主要为液相色谱-串联质谱法[28]，张翠芳等[29]建立了氰霜唑及其代谢物CCIM在黄瓜和土壤中的残留检测方法。虽然目前烯酰吗啉、氰霜唑及CCIM均有较多的检测方法，但在我国，复配农药因其独特的特点，已被广泛应用于植物生长中，所以单一农药检测方法已不能满足要求，建立高效的多种农药同时检测的方法显得尤为重要。虽然王艳敏[30]报道了烯酰吗啉和氰霜唑复配药物的高效液相色谱测定方法，但其未对实际样品进行检测。目前未见关于烯酰吗啉、氰霜唑及其代谢物CCIM同时检测的文献报道。

本文以黄瓜和土壤为研究对象，采用QuEChERS/液相色谱-串联质谱法，建立了黄瓜和土壤中烯酰吗啉、氰霜唑及其代谢物CCIM的同步检测方法；通过两年三地田间残留试验，研究35%氰霜唑·烯酰吗啉悬浮剂在黄瓜和土壤中的残留动态及最终残留量，以期确定烯酰吗啉和氰霜唑在黄瓜上的安全间隔期，并为其在农产品中的安全使用和风险评估提供科学依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

烯酰吗啉标准品、氰霜唑标准品、CCIM标准品(纯度99%，德国Dr.E公司)；35%氰霜唑·烯酰吗啉悬浮剂(江西禾益化工股份有限公司)；乙腈、甲酸(色谱纯，Fisher公司)；无水硫酸镁、氯化钠(分析纯，北京化工厂)；乙二胺-N-丙基硅烷键合相(PSA)、十八烷基硅烷键合相(C18)(天津博纳艾杰尔科技有限公司)；Milli-Q超纯水(法国Millipore公司)。

Agilent 1200液相色谱仪、API2000串联四极杆质谱仪(美国Agilent公司)；涡旋混合器(北京昊诺斯科技有限公司)；电子天平(北京赛多利斯公司)；高速冷冻离心机(美国Thermo公司)。

1.2 样品前处理

黄瓜：准确称取粉碎后的黄瓜样品10 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋2 min，再加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，涡旋2 min后，以8 000 r/min离心5 min，上清液为提取液，待净化。取1.0 mL上清液于装有50 mg PSA净化剂的10 mL离心管中，涡旋2 min，以5 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm有机滤膜，上机检测。

土壤：准确称取土壤样品10 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，净化时加入50 mg PSA和50 mg C18净化剂，其余步骤同上。

1.3 仪器条件

色谱条件：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；等度洗脱，流动相为0.5%甲酸水-甲醇(25∶75，体积比)，流速：0.3 mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子模式；喷雾电压(IS+)：5 500 V；离子源温度(TEM)：450 ℃；碰撞室入口电压(EP)：10 V；碰撞室出口电压(CXP)：4 V；雾化气(GS1)：34.5×103Pa；辅助气(GS2)：82.7×103Pa；气帘气(CUR)：89.6×103Pa。多反应监测(MRM)模式下烯酰吗啉、氰霜唑和CCIM的质谱参数见表1。

表1 多反应监测模式下烯酰吗啉、氰霜唑和CCIM的质谱参数

*quantitative ion pair

1.4 标准溶液的配制及标准曲线的绘制

分别称取烯酰吗啉、氰霜唑和CCIM的标准品0.01 g(精确至0.000 1 g)，用乙腈溶解并定容至100 mL，制得100 mg/L的标准储备液，-20 ℃保存。分别吸取3种标准溶液1 mL，用乙腈定容至10 mL容量瓶中，配成10 mg/L的混合标准溶液，于4 ℃下避光储存。根据需要，用乙腈稀释成不同质量浓度的标准工作溶液，即用即配。

烯酰吗啉、氰霜唑和CCIM混合标准溶液用乙腈、空白黄瓜和土壤提取液稀释，配得0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/L系列混合标准溶液，在上述液相色谱-串联质谱条件下测定，重复3次，选择不同的离子对，分别以3种农药的进样质量浓度(x，mg/L)为横坐标，对应峰面积(y)为纵坐标，建立标准曲线。

1.5 加标回收实验

在黄瓜、土壤空白样品中添加0.05、0.1、0.5 mg/kg 3个水平的混合标准溶液，静置20 min，提取和净化操作同“1.2”。每个加标水平重复5次，以上述实验条件测定回收率。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1色谱柱及流动相的选择考察了不同色谱柱和流动相体系的色谱分离效果。分别以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水和甲醇-0.1%甲酸水为流动相对X Bridge C18色谱柱和Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱进行比较;X Bridge C18色谱柱对目标物的保留能力弱，在2 min之内出峰，且在3种流动相下的峰形均不理想、分离效果较差;Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱对目标物保留能力较好，以甲醇-0.1%甲酸水作为流动相时的峰形和分离效果较好，这是由于在流动相中加少量甲酸可以提高离子化效率，优化峰形，通过优化甲酸水的含量以及与甲醇的体积比，最终选择Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱，甲醇-0.5%甲酸水(75∶25)为流动相。在该条件下烯酰吗啉、氰霜唑和CCIM均可获得较好的分离效果和色谱峰形，三者的提取离子流图见图1。

2.1.2净化剂的选择黄瓜等植物源性农产品的提取液中含有的糖类、色素、脂肪酸和甾醇等杂质会对回收结果产生一定的影响，需除去这些杂质。比较了50 mg PSA+50 mg C18、50 mg PSA以及不加净化剂对样品中目标物净化回收效果的影响。结果表明，黄瓜样品提取液中加入50 mg PSA+50 mg C18时，回收率偏高(116%～128%)。加入50 mg PSA时回收率符合要求(79.6%～94.4%)，不加净化剂时因受基质中杂质的干扰，回收率不符合要求(60.8%～66.6%)。土壤样品提取液选用50 mg PSA+50 mg C18净化时，回收率符合检测要求(86.5%～103%)，而单独使用PSA和不使用净化剂时，回收率(47.8%～76.8%)均较低。最终确定50 mg PSA为黄瓜样品提取液的净化剂，50 mg PSA+50 mg C18为土壤样品提取液的净化剂。

2.2 基质效应、线性关系及定量下限

在HPLC-MS/MS分析中，电喷雾离子源易受样品基质影响，表现出离子抑制或离子增强效应，从而影响仪器的灵敏度和重复性[31]。为消除样品基质效应，本研究选用空白样品提取液稀释标准溶液，以使标样和样品溶液具有相同的离子化条件，并考察了烯酰吗啉、氰霜唑和CCIM在乙腈、黄瓜和土壤基质中的线性范围、线性方程以及相关系数。结果表明：在0.01～0.5 mg/L范围内，烯酰吗啉、氰霜唑及CCIM在上述基质中的响应值与其浓度之间线性良好，相关系数为0.994 6～0.999 8。以方法的最低添加水平为定量下限(LOQ)[32]，得黄瓜和土壤中3种化合物的LOQs均为0.05 mg/kg，低于国内外残留限量[15-19]，该方法的灵敏度可满足国内和国际残留限量的测定要求。

2.3 方法的准确度与精密度

按“1.5”进行加标回收实验，结果显示，在0.05～0.5 mg/kg加标范围内，黄瓜和土壤样品中烯酰吗啉、氰霜唑及CCIM的平均回收率为78%～105%，相对标准偏差(RSD，n=5)为1.3%～14.8%(表2)。表明该方法具有较好的准确度、重复性及精密度，满足农药残留分析的要求。典型加标样品的色谱图见图2，其中烯酰吗啉为顺反异构体[33]，故出现两个峰，本研究中烯酰吗啉的检测量为两种异构体之和。

表2 黄瓜和土壤中烯酰吗啉、氰霜唑及CCIM的加标回收率及相对标准偏差(n=5)Table 2 Average recoveries and RSDs for dimethomorph，cyazofamid and CCIM in cucumber and soil samples(n=5)

2.4 消解动态与最终残留分析

为验证该方法的可靠性和实用性，采用本方法对北京市通州区、济南市历城区和哈尔滨市三地2015～2016年两年的黄瓜和土壤田间实际样品(21 d最终残留和黄瓜中残留量)进行测定，供试药剂为35%氰霜唑·烯酰吗啉悬浮剂，消解动态实验中黄瓜施药剂量(393.75 g a.i/ha)，土壤施药剂量(1 000 g a.i/ha)，施药后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d采样。最终残留试验按照低剂量(262.5 g a.i/ha)、高剂量(393.75 g a.i/ha)各施药2次、3次(施药间隔7 d)，收获期采一次(采样距末次施药间隔期1、2、3、5 d)。结果表明：在黄瓜和土壤消解动态样品中烯酰吗啉残留量分别为ND～7.21、ND～5.20 mg/kg，氰霜唑及其代谢物CCIM之和的残留量分别为ND～4.32、ND～2.21 mg/kg，在施药7、14 d后，烯酰吗啉和氰霜唑残留量均小于最低检测浓度，表明黄瓜和土壤样品中烯酰吗啉、氰霜唑及CCIM的最终残留量随采收时间的延长呈递减趋势(其中ND表示农药残留量低于LOQs)，烯酰吗啉在黄瓜和土壤中的半衰期为1.2～2.1、3.0～9.6 d；氰霜唑与CCIM之和在黄瓜和土壤中的半衰期为0.9～2.3 d、1.8～6.2 d，氰霜唑与CCIM之和比烯酰吗啉的降解速率快，另外不同地区的降解速率也不同，可能是受天气、作物生长状况差异以及土壤类型等因素的影响。在合理的使用情况下，35%氰霜唑·烯酰吗啉悬浮剂不会造成黄瓜和土壤中烯酰吗啉、氰霜唑及CCIM残留污染。在黄瓜和土壤样品中，烯酰吗啉的最终残留量分别为ND～7.60、ND～2.22 mg/kg，氰霜唑及其代谢物CCIM之和的最终残留量分别为ND～3.58、ND～0.31 mg/kg，距采收间隔期3 d的黄瓜中烯酰吗啉最高残留量为4.26 mg/kg，氰霜唑及CCIM之和的最高残留量为0.17 mg/kg，均低于我国规定的黄瓜中烯酰吗啉的MRL值(5 mg/kg)和氰霜唑及其代谢物之和的MRL值(0.5 mg/kg)，故建议其采收安全间隔期为3 d。

图2 空白样品及加标样品的色谱图Fig.2 Chromatograms of blank and spiked samplesA:blank cucumber;B:cucumber spiked with 0.5 mg/kg dimethomorph;C:cucumber spiked with 0.5 mg/kg cyazofamid;D:cucumber spiked with 0.5 mg/kg CCIM

3 结 论

本研究基于QuEChERS前处理技术，建立了一种同步检测分析黄瓜和土壤中烯酰吗啉、氰霜唑及其代谢物CCIM的HPLC-MS/MS检测方法。该方法简单、快速、灵敏度及准确度高，能够满足同时快速检测和确证黄瓜和土壤中烯酰吗啉、氰霜唑及其代谢物的要求，可应用于农药登记残留田间试验样品中的农药残留分析。另外，对黄瓜和土壤实际样品的测定，以及对35%氰霜唑·烯酰吗啉悬浮剂在黄瓜和土壤中的残留动态及最终残留量的分析，可为烯酰吗啉和氰霜唑的科学使用、在黄瓜上的安全间隔期，以及黄瓜中烯酰吗啉、氰霜唑及CCIM的残留分析和风险评估提供重要的数据支撑。